血漿循環(huán)游離DNA水平及其完整性用于肺結(jié)節(jié)良惡性的診斷研究

居冠軍, 施民新, 樊懌輝, 陳賽華, 劉紅利, 龔海鵬, 朱桂娟

(江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院, 1. 胸外科, 2. 檢驗科, 3. 影像科, 江蘇 南通, 226361)

肺結(jié)節(jié)是指影像學(xué)表現(xiàn)為局灶性、類圓形、密度增大、直徑≤3 cm且周圍被含氣肺組織包繞的實性或亞實性肺部陰影,而肺癌在早期常表現(xiàn)為肺結(jié)節(jié)。盡早鑒別診斷肺結(jié)節(jié)良惡性,對于改善治療效果和預(yù)后具有重要意義[1-2]。目前,組織病理學(xué)檢查依然是診斷非小細胞肺癌(NSCLC)的金標準,但其具有創(chuàng)傷性,且對較小腫瘤組織的操作難度較大,影像學(xué)檢查則可了解肺癌的部位及大小,但對小結(jié)節(jié)的敏感度有限。循環(huán)游離DNA(cfDNA)是指循環(huán)血中游離于細胞外的高度片段化DNA, 源于正常細胞或腫瘤細胞,在卵巢癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中水平升高,可用于腫瘤的篩查和診斷[3-4]。癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白19片段抗原21-1(Cyfra21-1)是腫瘤標志物,在肺癌患者血清中水平明顯升高,常被用于腫瘤診斷[5-6]。既往已有研究[7]將cfDNA濃度和cfDNA完整性用于區(qū)分惡性腫瘤患者和健康人群,但其輔助診斷肺結(jié)節(jié)良惡性的價值尚有待進一步研究。本研究以病理結(jié)果為金標準,探討血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1檢測對肺結(jié)節(jié)良惡性的診斷價值,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月—2020年10月在南通市腫瘤醫(yī)院就診的110例良惡性肺結(jié)節(jié)患者作為研究對象,其中男68例,女42例,年齡22～78歲,平均(48.30±8.10)歲,良性肺結(jié)節(jié)60例,惡性肺結(jié)節(jié)50例(肺腺癌31例、鱗癌19例)。納入標準: ① 經(jīng)CT診斷為肺結(jié)節(jié),且經(jīng)病理學(xué)確診者; ② 血液采集前未接受手術(shù)、放化療等抗腫瘤治療者; ③ 臨床資料完整者。排除標準: ① 嚴重心、肝、腎功能不全者; ② 伴有其他類型惡性腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)者。另選取同期健康體檢人員30例設(shè)為對照組,其中男21例,女9例,年齡22～75歲,平均(47.80±8.30)歲。各組研究對象性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)南通市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(批準文號2018-039), 且患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及保存: 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL, 裝入抗凝管中,于室溫條件下靜置30 min, 以3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后收集血漿,置于無菌EP凍存管中, -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測cfDNA水平: 使用cfDNA快速提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取血漿中總cfDNA, 試劑盒購自德國Qiagen公司,使用核酸定量儀測定波長260 nm與280 nm處的光密度比值(OD260 nm/OD280 nm), 將OD260 nm/OD280 nm為1.6～1.8的樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎胵RT-PCR檢測各研究對象血漿cfDNA水平,以ALU115基因(115 bp)表示cfDNA濃度,以ALU247基因/ALU115基因表示cfDNA的完整性。ALU115引物擴增的基因包含所有的cfDNA片段(細胞凋亡途徑與非凋亡途徑),ALU247引物擴增的基因為非凋亡途徑釋放的cfDNA片段, cfDNA完整性接近1, 表示cfDNA來自于非細胞凋亡途徑。ALU115及ALU247引物序列見表1, 引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR總體系為20 μL, 循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性30 s, 95 ℃變性15 s, 65 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 s, 共38個循環(huán),擴增后檢測光密度值。以人類基因組DNA為標準品(美國Promega公司)繪制擴增曲線,其中標準曲線回歸方程為Y=-3.186logX+39.87, 線性關(guān)系良好(R2=1), 根據(jù)標準曲線對cfDNA含量及熔解曲線進行分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 檢測血漿CEA、Cyfra21-1水平: 采用化學(xué)發(fā)光法檢測血漿CEA、Cyfra21-1水平, CEA、CYFRA21-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自羅氏公司,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,不符合正態(tài)分布的計量資料采用[M(P25,P75)]描述,組間比較采用非參數(shù)檢驗,繪制受試者工作特征(ROC)曲線,分析血漿cfDNA水平及完整性、CEA、Cyfra21-1對惡性肺結(jié)節(jié)的診斷價值,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿cfDNA水平、cfDNA完整性比較

惡性肺結(jié)節(jié)組患者血漿cfDNA水平、cfDNA完整性均高于良性肺結(jié)節(jié)組、對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 良性肺結(jié)節(jié)組血漿cfDNA水平、cfDNA完整性與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.113、0.067)。見表2。

表2 3組血漿cfDNA水平、cfDNA完整性比較[M(P25, P75)]

2.2 血漿cfDNA水平、cfDNA完整性與惡性肺結(jié)節(jié)患者臨床病理特征的相關(guān)性

血漿cfDNA水平、cfDNA完整性與惡性肺結(jié)節(jié)患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05), 見表3。

表3 血漿cfDNA水平、cfDNA完整性與惡性肺結(jié)節(jié)患者臨床病理特征的相關(guān)性[M(P25, P75)]

2.3 血漿CEA、Cyfra21-1表達水平比較

惡性肺結(jié)節(jié)組血漿CEA、Cyfra21-1表達水平均高于良性肺結(jié)節(jié)組、對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 良性肺結(jié)節(jié)組血漿CEA、Cyfra21-1水平與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.073、0.095)。見表4。

表4 3組血漿CEA、Cyfra21-1水平比較[M(P25, P75)] ng/mL

2.4 血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性對惡性肺結(jié)節(jié)的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示,血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性對惡性肺結(jié)節(jié)均具有一定的診斷價值,但敏感度與特異度較低; 血漿cfDNA水平、cfDNA完整性診斷惡性肺結(jié)節(jié)的曲線下面積、敏感度、特異度均大于或高于CEA、Cyfra21-1; 血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者聯(lián)合診斷惡性肺結(jié)節(jié)的敏感度、特異度均高于四者單獨檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性對惡性肺結(jié)節(jié)的診斷效能

3 討 論

NSCLC約占肺癌的80%, 早期癥狀不明顯或缺乏特異癥狀,多數(shù)患者確診時已處于疾病中晚期, 5年生存率僅16%～18%, 是癌癥相關(guān)死亡的首要原因。因此,尋找穩(wěn)定可靠的早期診斷生物標志物對早期診治NSCLC和提高患者生存率具有重要意義[8-9]。

cfDNA是一種游離DNA, 可來源于人體凋亡或壞死的正常細胞,也可來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞。研究[10-11]表明,腫瘤患者血漿中cfDNA水平顯著高于健康人,且cfDNA在腫瘤良惡性的鑒別診斷中具有重要意義。另有研究[12]發(fā)現(xiàn),與健康者相比, NSCLC患者的血漿游離DNA水平顯著升高,提示該指標水平在NSCLC早期診斷中具有一定的臨床價值。王宇軒等[13]發(fā)現(xiàn), cfDNA在NSCLC患者血漿中的表達水平顯著高于肺部良性結(jié)節(jié)患者,對肺結(jié)節(jié)良惡性具有一定的診斷價值。本研究結(jié)果亦顯示,與良性肺結(jié)節(jié)組比較,惡性肺結(jié)節(jié)組患者血漿cfDNA水平、cfDNA完整性均顯著升高,其原因可能是在肺結(jié)節(jié)惡性進展過程中,局部組織供血不足,引起細胞壞死或凋亡, DNA釋放,造成血漿cfDNA水平升高。SOLIMAN S E S等[14]研究表明, NSCLC患者血清cfDNA水平與NSCLC分期和轉(zhuǎn)移有關(guān),且血漿血清cfDNA水平和完整性指數(shù)在NSCLC早期診斷和預(yù)后預(yù)測方面具有一定價值。與此不同的是,本研究結(jié)果顯示, cfDNA水平和cfDNA完整性與臨床病理特征無相關(guān)性,這可能與本研究樣本量較少有關(guān)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示,血漿cfDNA水平、cfDNA完整性診斷惡性肺結(jié)節(jié)的曲線下面積、敏感度、特異度均大于或高于CEA、Cyfra21-1, 提示cfDNA水平和cfDNA完整性對惡性肺結(jié)節(jié)具有一定的診斷價值,但特異度與敏感度均不高。研究[15]顯示,血漿cfDNA聯(lián)合血清標志物可提高對早期胃癌的診斷靈敏度。

CEA為臨床常見的腫瘤標志物,在乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種腫瘤患者中表達水平升高,可用于良惡性腫瘤的診斷;此外, CEA在惡性肺結(jié)節(jié)患者血清中表達水平升高,為孤立性肺結(jié)節(jié)的鑒別標志物[16-17]。Cyfra21-1是一種上皮來源性質(zhì)的新腫瘤標志物,主要表達于肺組織,肺部發(fā)生癌變時,其被釋放至血液中,故肺癌患者血清Cyfra21-1水平較高[18]。Cyfra21-1是肺癌的腫瘤標志物之一,且對肺結(jié)節(jié)良惡性具有一定診斷價值,但需要與其他血清標志物聯(lián)合應(yīng)用以提高診斷效率[19]。范偉等[20]研究表明, NSCLC患者血清CEA、Cyfra21-1水平顯著升高,兩者聯(lián)合檢測對NSCLC具有較高的診斷效能。本研究結(jié)果顯示,惡性肺結(jié)節(jié)組患者血漿CEA、Cyfra21-1水平顯著高于對照組與良性肺結(jié)節(jié)組,良性肺結(jié)節(jié)組血漿CEA、Cyfra21-1水平與對照組無顯著差異,其可能原因是CEA為糖蛋白,是細胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白, Cyfra21-1為上皮細胞結(jié)構(gòu)蛋白亞單位,在惡性上皮細胞中,激活的蛋白酶加速了細胞降解,使大量蛋白被釋放至血液中, Cyfra21-1水平升高。本研究進一步分析CEA、Cyfra21-1對惡性肺結(jié)節(jié)的診斷價值,結(jié)果顯示兩者的敏感度、特異度均不高,但血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者聯(lián)合診斷惡性肺結(jié)節(jié)的敏感度、特異度顯著高于四者單獨檢測,提示四者聯(lián)合檢測對惡性肺結(jié)節(jié)具有較高的診斷效能,在肺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷中具有一定臨床價值。但本研究樣本量較少,未來還需擴大樣本量進一步研究cfDNA對肺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價值。

綜上所述,惡性肺結(jié)節(jié)患者血漿cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性均高于良性肺結(jié)節(jié)患者,血漿cfDNA水平和cfDNA完整性對惡性肺結(jié)節(jié)具有一定的診斷價值,可作為肺結(jié)節(jié)良惡性輔助診斷的分子生物學(xué)指標。