微小RNA-142-3p靶向腫瘤壞死因子-α對脂多糖誘導的人鼻黏膜上皮細胞炎癥反應的影響

司峰志, 周 旭

(新疆醫科大學第二附屬醫院 耳鼻喉科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

炎性反應是慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)的主要病理改變[1], 如何抑制鼻腔黏膜上皮細胞的炎性反應成為關鍵。微小RNA(miRNA)是一類非編碼的小分子RNA, 在多種疾病進展中發揮作用[2-4]。miR-142-3p與細胞的炎性反應相關,參與炎性疾病的發生發展[5-7]。但有關miR-142-3p與CRSwNP關系的研究較少。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可誘導白細胞介素(IL)-6、IL-10和干擾素γ(IFN-γ)的釋放[8]。研究[9]表明, TNF-α在慢性鼻竇炎患者鼻腔黏膜及血清中高表達。但TNF-α在CRSwNP炎性反應中的作用尚不清楚。本研究通過脂多糖(LPS)處理鼻腔黏膜上皮細胞建立炎性反應模型,觀察miR-142-3p對LPS處理后的鼻腔黏膜上皮細胞炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人鼻黏膜上皮細胞(HNEPC, 長沙豐暉生物有限公司), LPS(L5293, Sigma公司,美國), RPMI-1640(11875101, BI, 以色列), miR-142-3p 上調、miR-142-3p下調、空質粒及引物(廣州銳博生物有限公司),野生型TNF-α載體(TNF-α-WT)、突變型TNF-α載體(TNF-α-MUT)、TNF-α下調質粒及下調對照質粒(天津擎科生物有限公司), Lipofectamine 3000、TRIzol(L3000015, 15596018, Thermo公司,美國), Luciferase試劑盒(16170, Thermo公司,美國),逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(638315, Tarkara公司,日本),四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒(25830, 天津天裔生物有限公司), IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α酶聯免疫吸附試驗試劑盒(EK0410, EK0416, EK0373, EK0527, 武漢博士德生物有限公司),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(D0010, 北京Solarbio公司), HBS-1096A酶標儀(南京貝燈醫療器械有限公司), ABI7500型PCR儀(ABI公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及模型構建: HNEPC使用RPMI-1640培養,用不同濃度LPS(0.1、0.5、1.0 μg/mL)處理細胞,正常培養的細胞為對照組,培養24、48、72 h。細胞及上清液中炎性因子含量較對照組下降提示模型構建成功[10]。

1.2.2 細胞轉染及分組: 將miR-142-3p 上調、miR-142-3p下調、空質粒分別轉染細胞,用0.5 μg/mL LPS處理記為LPS組、miR-142-3p上調組、miR-142-3p下調組、空質粒組; 將TNF-α下調質粒及下調對照質粒分別轉染至miR-142-3p上調組細胞及0.5 μg/mL LPS處理過的細胞,記為miR-142-3p上調+TNF-α下調組、空質粒+TNF-α下調組、TNF-α下調組及下調對照組。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖: 每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板,培養72 h后加入150.0 μL MTT反應30 min, 對照組加入等量二甲基亞砜(DMSO), 酶標儀檢測490 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞、組織miR-142-3p和IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-αmRNA表達水平: 取對數生長期的細胞,胰酶消化,離心。加入1 mL Trizol利用一步法提取總RNA, 檢測濃度,根據試劑盒說明書合成cDNA, 反應條件為30 ℃ 10 min, 42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。按照熒光定量試劑盒說明進行PCR, 體系為ddH2O 9.0 μL, TB Green Advantage Premix (2×) 12.5 μL, ROX Dye (50×) 0.5 μL, miRNA-specific primer (10 μmol/L)及mRQ 3′ Primer (10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 2.0 μL。循環條件為95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40個循環,構建溶解曲線,相對表達量用2-△△Ct法計算。內參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量: 收集細胞培養液,離心后保留上清液,采用酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α OD值,根據標準曲線計算濃度。

1.2.6 在線網站預測miR-142-3p與TNF-α的靶向關系: 使用TargetScan在線網站(http: //www.targetscan.org/)預測miR-142-3p與TNF-α的靶向關系。

1.2.7 熒光素酶報告實驗: 將空質粒或miR-142-3p上調質粒分別與TNF-α-WT、TNF-α-MUT載體共轉染至HNEPC, 48 h后裂解各組細胞并收集上清液,按照試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 miR-142-3p對HNEPC增殖活性的影響

LPS組細胞增殖能力高于對照組, miR-142-3p上調組細胞增殖能力高于空質粒組, miR-142-3p下調組細胞增殖能力低于空質粒組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1。

2.2 miR-142-3p對HNEPC細胞炎性因子水平的影響

LPS組細胞IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α蛋白及其mRNA表達水平高于對照組, miR-142-3p上調組細胞相關炎性因子表達水平高于空質粒組, miR-142-3p下調組細胞相關炎性因子表達水平低于空質粒組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2、圖3。

2.3 TNF-α對HNEPC細胞炎性因子表達水平的影響

TNF-α下調組細胞IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-αmRNA及其細胞上清液中蛋白表達水平低于下調對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4、圖5。

2.4 miR-142-3p與TNF-α的靶向關系

生物信息學預測發現,TNF-α與miR-142-3p存在一定的結合位點。miR-142-3p上調+TNF-α-WT組熒光素酶活性高于空質粒+TNF-α-WT組,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖6。

2.6 TNF-α抑制劑對miR-142-3p過表達的影響

miR-142-3p上調+TNF-α下調組細胞TNF-αmRNA及其蛋白表達水平低于miR-142-3p上調組,差異有統計學意義(P<0.01), 見圖6。

3 討 論

CRSwNP的發病機制尚未闡明,炎癥反應在CRSwNP的發生發展中發揮重要作用[11], 探討調控CRSwNP炎癥反應的機制意義重大。

miRNA在調控CRSwNP炎癥反應中發揮作用[2-4]。多種腫瘤中miR-142-3p差異表達,其與腫瘤的惡性生物學行為有關[12-14]。此外, miR-142-3p在炎癥性疾病中也異常表達[5-7]。但miR-142-3p在CRSwNP中的作用尚不清楚。LPS誘導HNEPC是研究CRSwNP的常用模型[15]。本研究結果顯示, LPS誘導的HNEPC增殖能力增強,且轉染miR-142-3p過表達可增強細胞增殖能力。研究[16-17]表明, 炎性因子在CRSwNP鼻腔黏膜組織中高表達,與疾病的進展相關。本研究結果顯示, LPS誘導的HNEPC高表達IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α, 細胞上調miR-142-3p可升高炎性因子的表達,下調miR-142-3p可抑制炎性因子的表達,提示miR-142-3p具有促進CRSwNP炎癥反應的功能。

miRNA一般通過與下游的靶基因3′-UTR結合發揮作用。本研究首先通過生物信息學預測了miR-142-3p的靶基因,發現TNF-α基因mRNA 3′-UTR與miR-142-3p存在互補的堿基對。TNF-α可增強炎性細胞的吞噬、分泌功能,還可調控多種信號通路,促進炎性因子的分泌[18-20]。研究[21-23]表明, LPS刺激的多種細胞可高表達TNF-α。研究[24-25]發現, LPS可增加HNEPC中TNF-α的表達,與本研究結果一致。進一步研究發現,下調LPS誘導的HNEPC的TNF-α表達后,細胞IL-6、IL-10、IFN-γ表達水平也顯著下降,提示TNF-α調控LPS誘導的HNEPC炎性反應。本研究采用熒光素酶實驗進一步驗證miR-142-3p對TNF-α的直接調節作用,結果表明, miR-142-3p與TNF-α具有靶向關系。上述結果證實TNF-α是miR-142-3p的靶基因, miR-142-3p可靶向促進TNF-α表達。但本研究存在一定局限性:首先,本研究入選病例數較少,有待增加樣本量進一步驗證miR-142-3p、TNF-α的表達情況;其次,對于miR-142-3p調控炎癥反應的信號通路需要進一步探討。

綜上所述, miR-142-3p、TNF-α在LPS誘導的HNEPC中表達升高。上調miR-142-3p可顯著增強LPS誘導后HNEPC的增殖和相關炎癥因子的表達。TNF-α是miR-142-3p的靶基因,提示miR-142-3p可能通過調控TNF-α發揮抑制作用。