血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7表達對非小細胞肺癌的診斷價值研究

蘇 芳, 石志浩, 趙 靜, 陳 萍, 李 堅

(江蘇大學附屬醫院, 1. 呼吸與危重癥醫學科, 2. 老年醫學科, 江蘇 鎮江, 212001)

肺癌是常見的腫瘤之一,發病率及病死率均位居高位[1]。在中國,根據2022年國家癌癥中心發布的全國癌癥數據結果,每年80多萬人被診斷為肺癌,近85%肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)[2]。高發病率、進展快、高病死率、預后差是NSCLC的主要流行病學特點[3]。臨床上,少部分NSCLC患者可在早期(Ⅰ期或Ⅱ期)被明確診斷[4], 超過60%的肺癌患者因局部晚期或遠處轉移等表現診斷癌癥晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)[5], 侵襲、轉移和復發是NSCLC的重要特點,與預后不良密切相關[6]。早期發現、診斷并干預腫瘤生長,有助于降低病死率,改善預后,延長生存期。因此,尋找診斷NSCLC的高特異性、高敏感的生物標志物仍是防治肺癌的熱點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有組織特異性表達,影響細胞增殖、凋亡和分化,其可用于癌癥的診斷、預后和治療[7]。研究[8]表明, lncRNA小核仁宿主基因20(lncRNA-SNHG20)在NSCLC腫瘤組織中表達上調,促進NSCLC細胞的增殖和遷移,進而影響預后。lncRNA轉錄因子7(lncRNA-TCF7)在NSCLC腫瘤組織中表達上調,增強NSCLC細胞侵襲性和自我更新能力[9]。但目前關于NSCLC患者血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7相對表達的研究較少。本研究選取120例NSCLC患者和120例良性肺病患者作為研究對象,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對表達量,分析其與臨床病理特征的相關性,并探討SNHG20、TCF7診斷NSCLC的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

分別選擇2020年12月—2022年6月江蘇大學附屬醫院收治的120例NSCLC患者(NSCLC組)和良性肺病患者(良性肺病組)。NSCLC組: ① 經細胞學或組織病理學確診者; ② 首次確診,且原發病灶來源于肺部,未接受過手術、化療、放療等腫瘤干預措施者。NSCLC組中男68例,女52例; 年齡36～78歲; 病理組織分型為腺癌93例,鱗癌27例。根據UICC肺癌TNM分期(第8版)標準,臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期20例, Ⅲ～Ⅳ期90例,未明確分期10例。良性肺病組男65例,女55例; 年齡25～80歲; 疾病類型包括慢性阻塞性肺疾病48例,哮喘8例,支氣管擴張14例,肺炎50例。為保證檢測結果準確性,采集20例健康成人受試者血漿樣本用于lncRNA檢測結果校對。本研究已獲得醫院人文倫理委員會批準(批件號KY2022K0121)。

1.2 血漿標本采集及預處理

抽取研究對象5 mL外周靜脈血于EDTA抗凝管, 30 min內利用低速離心機留取上層血漿,置于-80 ℃冰箱凍存留用。同時送檢參與者血液標本至核醫學科檢測癌胚抗原(CEA)及細胞角蛋白19(Cyfra21-1, 參照試劑和說明書,正常參考值上限分別為5、7 ng/mL)。

1.3 RNA提取及逆轉錄

利用Trizols法提取上述標本血漿總RNA, 總RNA的濃度及純度用紫外分光光度計檢測。吸取固定體積的總RNA, 根據試劑盒說明書嚴格進行逆轉錄,逆轉錄結束標本可直接進行實時熒光定量PCR, 也可凍存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 實時熒光定量PCR

吸取2 μL上述逆轉錄所得的cDNA作為模板,嚴格遵循TB Green Premix Ex TaqTM試劑操作步驟執行,根據說明書配置反應體系后,應用實時熒光定量PCR儀進行兩步法PCR擴增。反應條件為預變性1個循環, 95 ℃, 30 s; PCR反應40個循環, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s。任一樣本的任一基因檢測皆設置3個復孔。內參基因為GAPDH, 利用2-△△CT法計算上述2種lncRNAs的相對表達量。引物序列:GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′, 下游引物為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′; lncRNA-SNHG20上游引物為5′-ATGGCTATAAATAGATAGATACACG-3′, 下游引物為5′-GGTACAAACAGGGAGGGA-3′; lncRNA-TCF7上游引物為5′-AGGAGTCCTTGGACCTGAGC-3′, 下游引物為5′-AGTGGCTGGCATATAACCAACA-3′。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表達水平

NSCLC組、良性肺病組血漿中lncRNA-TCF7的相對表達量分別為(3.327±0.232)、(3.124±0.135), lncRNA-SNHG20的相對表達量分別為(2.655±0.139)、(2.591±0.121)。與良性肺病組相比, NSCLC患者血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7表達水平上調,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 NSCLC患者血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對表達水平與臨床病理參數的關系

NSCLC患者血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對表達水平與性別、年齡、吸煙史、病理分型及臨床TNM分期無關(P>0.05), 見表1。

表1 NSCLC組血漿中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表達水平與臨床病理參數之間的關系

2.3 血漿中lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA和Cyfra21-1 對NCSLC的診斷效能

ROC曲線分析結果顯示, lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1單獨檢測診斷NSCLC的AUC分別為0.648(0.579～0.717)、0.769(0.710～0.829)、0.755(0.692～0.817)、0.642(0.571～0.713), lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7的AUC大于Cyfra21-1, CEA的AUC介于lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7之間。lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7聯合診斷的AUC為0.772(0.713～0.832), 大于上述4種任一單獨檢測的AUC。lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合Cyfra21-1的AUC為0.773(0.712～0.832), 低于lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合CEA的AUC0.882(0.839～0.926), 但大于lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合檢測的AUC。LncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1這4種指標單獨檢測及lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合檢測、lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合Cyfra21-1、lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合CEA的AUC比較,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2。

lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7分別聯合常規腫瘤標志物CEA及Cyfra21-1后AUC增大, lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯合CEA檢測診斷的敏感度提高。診斷NSCLC的cut-off值、陽性預測值、陰性預測值及準確性見表2。

表2 lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA及Cyfra21-1單獨診斷及聯合診斷NSCLC的效能

3 討 論

LncRNA是一組不具有蛋白翻譯功能、長度超過200個核苷酸的轉錄本[10]。LncRNA在不同類型腫瘤細胞中異常表達,在不同水平的基因表達中發揮調控作用[11]。近年來, lncRNA因其在癌癥中的調控作用而受到越來越多的關注。研究[12]發現, lncRNA異常表達可能會影響遺傳表觀信息,為腫瘤的細胞生長提供優勢,通過調節微小RNA(miRNA)或mRNAs參與癌癥進展。因此, lncRNA正在成為癌癥診斷和治療的新的標志物。

LncRNA-SNHG20位于染色體17q25.2, 具有2 183個堿基對,研究[13]認為過表達lncRNA-SNHG20可通過不同機制促進腫瘤細胞的細胞周期、增殖、侵襲和遷移能力。lncRNAs可以通過miRNAs調控卵巢癌的進展, lncRNA-SNHG20與卵巢癌的發生發展密切相關[14]。研究[15]發現,與正常人卵巢上皮細胞系相比,在4種卵巢癌細胞系中觀察到lncRNA-SNHG20顯著高表達,敲除lncRNA-SNHG20可抑制細胞增殖并誘導卵巢癌細胞凋亡。研究[16]表明,在卵巢癌組織和細胞中, lncRNA-SNHG20和MCL1水平上調,而miR3383p水平下調,經雙熒光素酶報告分析進行發現lncRNA-SNHG20通過靶向miR-338-3p來增加MCL1的表達,從而促進卵巢癌的發展。相關研究通過檢測68例結直腸癌組織及鄰近正常組織的lncRNA-SNHG20表達水平發現, lncRNA-SNHG20在癌組織中呈高表達,而且癌細胞系中lncRNA-SNHG20的表達顯著增加。miR495是lncRNA-SNHG20的直接靶點, STAT3被確定為結直腸癌中miR495的下游靶點, LncRNA-SNHG20通過調節STAT3表達和miR495促進結直腸癌進展[17]。此外,與癌旁組織相比,肺腺癌組織中lncRNA-SNHG20呈過表達,且lncRNA-SNHG20在肺腺癌細胞系中的表達高于正常上皮細胞系。進一步研究發現, lncRNA-SNHG20直接結合肺腺癌細胞中的miR-342, 而miR-342又直接結合DDX49, lncRNA-SNHG20通過海綿介導miR-342上調DDX49, 促進肺腺癌細胞增殖、侵襲和抑制凋亡[18]。本研究結果顯示, NSCLC患者血漿中lncRNA-SNHG20呈高表達,與既往研究中lncRNA-SNHG20在肺癌、卵巢癌、結直腸癌等腫瘤組織中高表達結果相符。此外, NSCLC患者血漿中lncRNA-SNHG20表達上調,與年齡、吸煙史、性別、病理組織分型、臨床分期等無明顯相關性,檢索Gepia數據庫發現lncRNA-SNHG20的相對表達水平與NSCLC總生存期無明顯相關性。

TCF7主要在T細胞中表達,在NK細胞及先天淋巴細胞的發育中其關鍵作用[19]。研究[20]發現,經IL-6/STAT3反激活誘導TCF7,通過上皮間質轉化促進肝細胞癌的侵襲性。體外實驗表明,敲低lncRNA-TCF7可以降低SK-Hep-1肝癌細胞系的細胞侵襲能力。研究表示, TCF7在結直腸癌細胞系中相對于正常結直腸上皮細胞高表達。免疫沉淀及熒光素酶報告基因分析顯示,lncRNA-TCF7招募BAF170激活TCF7啟動子,并調控TCF7表達。研究[21]表明, lncRNA-TCF7的下調可通過抑制TCF7的表達來抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲。通過流式細胞術及轉染試驗表明,沉默癌細胞中TCF7可抑制細胞增殖、遷移與侵襲,但對細胞凋亡無明顯影響。表達lncRNA-TCF7可以增加細胞侵襲能力,而shRNA沉默lncRNA-TCF7可以降低NSCLC細胞侵襲能力[9]。因此,上述研究表明,lncRNA-TCF7在多種癌癥中發揮促進腫瘤生長作用。本研究結果顯示, NSCLC患者血漿中lncRNA-TCF7呈高表達,與上述研究腫瘤組織及細胞系高表達相符。同時, NSCLC患者血漿中lncRNA-TCF7高表達與年齡、吸煙史、性別、病理組織分型、臨床分期等無明顯相關性,但檢索ULCAN數據庫發現TCF7不僅在肺腺癌呈高表達,且在早期腺癌中TCF7的表達具有統計學意義(P<0.05)。但本研究數據表明, NSCLC患者血漿中lncRNA-TCF7的表達水平與臨床分期無明顯相關性,考慮可能與本研究中早期樣本僅20例有關。

本研究中,單獨檢測lncRNA-TCF7的AUC(0.769)大于常規腫瘤標志物CEA(0.755)和Cyfra21-1(0.642), 且lncRNA-TCF7的特異度(87.5%)高于CEA(78.2%)和Cyfra21-1(67.5%)。單獨檢測lncRNA-SNHG20的AUC(0.648)介于CEA(0.755)和Cyfra21-1 (0.642)之間,但lncRNA-SNHG20的敏感度為81.5%, 高于CEA的72.5%和Cyfra21-1的60.5%。聯合檢測lncRNA-TCF7及lncRNA-SNHG20的AUC為0.772, 敏感度為73.2%, 大于TCF7單獨檢測的AUC, 但低于lncRNA-SNHG20單獨檢測的敏感度; 特異度(80.2%)低于TCF7單獨檢測,但高于lncRNA-SNHG20(42.5%)、CEA(78.2%)及Cyfra21-1(67.5%)。聯合檢測lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的AUC(0.882)、敏感度(79.0%)、特異度(83.3%)均高于聯合檢測lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+Cyfra21-1的AUC(0.773)、敏感度(73.2%)、特異度(80.2%)。此外,不僅聯合檢測lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的敏感度提高,而且檢測的準確性也提高,其可能成為NSCLC診斷的新的腫瘤標志物。

綜上所述,與良性肺病患者相比, NSCLC患者血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7呈高表達。血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的高表達與吸煙史、年齡、性別、病理分型、臨床分期無明顯相關性。lncRNA-TCF7、lncRNA-SNHG20和CEA聯合診斷的敏感度及準確性高于單獨診斷。但是,目前NSCLC的確診仍需病理學依據,而早期肺癌多無明顯臨床癥狀, lncRNA-TCF7和lncRNA-SNHG20或可作為分子標志物在NSCLC的篩選中發揮作用。