干腌牛肉加工過程中蛋白質結構變化

伏慧慧，潘麗，王慶玲

石河子大學食品學院（石河子 832000）

基于新疆得天獨厚的資源優勢，通過干腌肉制品加工技術，鮮牛脊肉經腌制、風干、發酵和成熟工藝制得極具新疆地域特色的干腌牛肉，其有獨特的口感、豐富的營養特性且便于貯藏[1]。然而干腌牛肉并未形成工業化生產規模，流通量較少，因而鮮有人知。

干腌肉制品中蛋白質的組成、含量、生化特性的變化及穩定性均關系到產品的營養、風味、質構、色澤等多方面的品質特性。蛋白質結構變化是多種生化修飾的結果，可引起蛋白質溶解性、疏水性的變化，進而對產品的品質產生不同程度影響[2]。蛋白質分子中氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用的變化是因腌制環境的改變，導致蛋白質空間構象改變，最終影響產品的功能特性。腌臘加工過程中因蛋白質結構的改變及水解、氧化使肉制品產生風味前體物質[3]。

試驗以干腌牛肉加工過程中工藝點為研究對象，主要研究蛋白質結構、濁度、溶解度、表面疏水性及蛋白質分子相互作用力變化，從而明確蛋白質結構變化對干腌牛肉品質的影響，為進一步研究干腌牛肉產品品質提供理論參考，為新疆牛肉加工制品工業化提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮褐牛脊肉（購自烏魯木齊市農貿市場）。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、三氯乙酸、氫氧化鈉、溴酚藍等（均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 儀器與設備

Neofuge 15R高速冷凍離心機（力康發展有限公司）；X7酶標儀（基因有限公司）；IKA-T25高速分散器（上海巴玖實業有限公司）；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（SEM，日本電子公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

工藝流程：鮮牛脊肉→腌制→風干→發酵→成熟→成品。

工藝條件：將鮮牛脊肉冷藏48 h（4 ℃），按樣品總量6.0%稱取食鹽并均勻揉搓在樣品表面，在8 ℃，Hr65%腌制35 d；牛脊肉洗后于10 ℃，Hr60%風干15 d；發酵80 d（20 ℃，Hr70%，40 d；24 ℃，Hr75%，40 d），于27 ℃、Hr70%成熟50 d即得成品。

分別采集原料（0 d）、腌制期（35 d）、風干期（50 d）、發酵期（130 d）、成熟期（180 d）5個階段牛脊肉樣品，置于-80 ℃冷藏備用。

1.3.2 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取

提取干腌牛肉中蛋白質參考冉麗丹等[4]的方法，并進行微調。肉樣破碎處理，稱取5.00 g樣品放入離心管，勻漿混勻前加入10 mL磷酸鹽緩沖液，并在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min后，取清液，重復操作2次，即得肌漿蛋白溶液（SP）。向剩余沉淀中加入10 mL磷酸鹽緩沖液，勻漿混勻、離心15 min（4 ℃，5 000 r/min），獲得清液，此重復操作2次，即得肌原纖維蛋白溶液（MP），蛋白濃度通過雙縮脲法測定。

1.3.3 干腌牛肉加工過程中微觀結構的觀察

將各工藝的蛋白溶液進行真空冷凍干燥，肉樣破碎處理，稱取5.00 g置于離心管中。采用SEM分析形態，在激發電壓下（10 kV）獲得圖片。

1.3.4 干腌牛肉加工過程中表面疏水性的測定

表面疏水性（HFS）的測定參考劉娟[5]的方法。取1 mL樣品蛋白稀釋液，加入200 μL溴酚藍，混勻后于搖床振蕩5 min（200 r/min，25 ℃），離心（5 000 r/min，15 min），取上清液，測定吸光度（595 nm），用A表示。同時做空白對照（磷酸鹽緩沖液），用A0表示。HFS（μg）按式（1）計算。

1.3.5 干腌牛肉加工過程中蛋白質分子相互作用力的測定

將不同加工時期干腌牛肉樣品用組織搗碎機破碎，準確稱取3.00 g，分別向肉樣中加入20 mL如下試劑：S1，0.6 mol/L的KCl溶液；S2，20 mmol/L的Tris溶液，pH 8.0；S3，20 mmol/L Tris包含1% SDS，pH 8.0；S4，20 mmol/L Tris包含8 mol/L尿素、1% SDS，pH 8.0；S5，20 mmol/L Tris包含8 mol/L尿素、1% SDS、2%β-巰基乙醇、pH 8.0；S6，0.5 mol/L NaOH溶液。

在25 ℃以150 r/min搖床振搖2.5 h，其中振搖S5樣品前，需在100 ℃水浴4 min。所有樣品溶液振搖后離心（5 000 r/min，20 min），取5 mL上清液，加入20%三氯乙酸并使三氯乙酸終濃度為10%，樣品在4 ℃避光靜置18 h，將樣品離心（5 000 r/min，20 min），經0.5 mol/L NaOH溶解沉淀，通過雙縮脲法對其蛋白質含量進行定量，結果以每一個樣品中蛋白含量所占S6的百分比表示[6]。

1.3.6 干腌牛肉加工過程中溶解度的測定

參考Xiong等[7]的方法對溶解度進行測定，稍作修改。將SP和MP蛋白稀釋至1 mg/mL，低溫離心（4℃，5 000 r/min，20 min），通過上清液測定蛋白質含量。蛋白質的氮溶指數（NSI）按式（2）計算。

1.3.7 干腌牛肉加工過程中濁度的測定

濁度的測定參考Xiong等[7]的方法，并作適當修改。將SP和MP蛋白稀釋至1 mg/mL，試管中各取5 mL蛋白稀釋液，分別于30，40，50，60和70 ℃的溫度加熱30 min，冷卻至室溫，測定吸光度（600 nm），同時做空白對照（磷酸鹽緩沖液）。根據吸光度的大小計算濁度。

1.4 數據統計分析

結果用平均值±標準差表示，每個工藝點重復測定3次，顯著水平P＜0.05，數據ANOVA分析使用SPSS Statistics 25.0軟件，圖表繪制通過Origin 2021軟件。

2 結果與討論

2.1 干腌牛肉微觀結構的變化

樣品表面形態及網絡結構的變化常用掃描電鏡來觀察。圖1顯示加工過程中干腌牛肉蛋白的微觀結構，干腌牛肉蛋白質結構在各時期均發生不同程度的變化。肌漿蛋白原料時結構結實致密、間隙小且分布均勻，隨著加工工序的開展，結構變得越來越疏松，間隙距離明顯增加，逐漸呈現不規則的形狀，結構破壞更加嚴重，同時，不斷出現肌漿蛋白溶出物。肌原纖維蛋白原料形狀規則、結構緊密、間隙小且分布均勻，在加工過程中逐漸呈現結構疏松，形狀不規則、間隙變大且分布極不均勻。成品時結構松散，聚集塊增加，間隙越來越大，且分布更加不均勻，形成眾多大小不一的蛋白聚集物。造成這些現象的原因是蛋白質氧化、水解使蛋白質分子的天然構象發生變化，使蛋白質結構由原料緊實至成熟期空洞松散，因而蛋白質主要作用力形成也發生改變，三維網狀結構的相互作用力減弱[8]。

圖1 干腌牛肉加工過程中蛋白微觀結構變化

2.2 干腌牛肉加工過程中表面疏水性的變化

蛋白質表面疏水基團分布及構象變化通常用蛋白質表面疏水性表示。由圖2可知，加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性呈顯著增加趨勢（P＜0.05）。從原料到成品時干腌牛肉的SP和MP分別增長49.13%和52.39%，這可能是因溫度升高、蛋白氧化引起蛋白質二級和三級結構改變，使疏水性氨基酸暴露出來[9]，同時，受到pH和食鹽量增加影響，蛋白質的表面疏水性增強。這與孫為正[6]對廣式臘腸的研究結果一致。

圖2 干腌牛肉加工過程中表面疏水性的變化

2.3 干腌牛肉加工過程中蛋白質相互作用力

蛋白質分子相互作用形成三維網絡結構影響著干腌牛肉產品的功能性質。圖3顯示加工過程中蛋白質分子相互作用力變化，S1從原料至腌制期增長3.96%，而后續加工至成熟期時降低14.55%。S2在加工過程中逐漸減少，降幅為12.31%。S1和S2降低是因蛋白質出現變性或降解，使其結構發生改變從而導致蛋白質作用力改變。S3呈現波動變化，從原料至腌制期的降幅為2.68%，至風干期增加8.90%，加工后期逐漸下降，到成品時降低21.81%。S4和S5呈先降后升的變化，從原料至腌制期分別下降11.20%和4.54%，而后逐漸上升，到成熟期增幅分別為39.37%和37.10%，試驗結果與表面疏水性的增加一致，說明加工過程中蛋白質氧化程度不斷加劇。在干腌牛肉由原料到成品時二硫鍵對蛋白質三維結構影響最大（即S5＞S4＞S3＞S2＞S1），該結果與孫為正[6]研究相吻合。干腌牛肉加工過程中蛋白質分子相互作用改變了蛋白質構象，使靜電相互作用減弱，而氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵明顯增強，蛋白質變性聚集對蛋白質結構形成和穩定性有重要影響。

圖3 干腌牛肉加工過程中蛋白質分子相互作用力變化

2.4 干腌牛肉加工過程中溶解度的變化

溶解性與氧化變性程度呈正相關。由圖4可知，加工過程中干腌牛肉的SP和MP溶解度均呈顯著降低的變化趨勢（P＜0.05），從原料至成熟期分別下降20.40%和25.56%，這主要因牛肉在腌制過程中疏水基團暴露及氧化使蛋白質交聯產生聚集和沉淀，導致蛋白質溶解性下降，這與鄒朝陽[10]研究結果變化趨勢一致。

圖4 干腌牛肉加工過程中蛋白質溶解性的變化

2.5 干腌牛肉加工過程中濁度的變化

蛋白質聚集情況可用濁度來反映。如圖5所示，加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濁度出現不同程度增長（P＜0.05）。在同一溫度梯度下，加熱0.5 h后，肌漿蛋白濁度吸光度在成品時分別增長0.149，0.192，0.118，0.088和0.103，肌原纖維蛋白濁度吸光度在成品時分別增長0.063，0.073，0.077，0.112和0.128，其增長是因加熱使蛋白分子相互作用形成大分子聚集體，使得光散射增加[11]，同時，巰基基團改變使蛋白質出現變性聚集，使濁度增加。干腌牛肉加工過程中濁度值增加越大，表明蛋白質結構改變及變性形成更大的聚集體。

圖5 干腌牛肉加工過程中蛋白質濁度的變化

3 結論

試驗結果表明：干腌牛肉在加工過程中蛋白質結構由緊致變得松散無序；氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵作用下形成蛋白質聚集體，且各作用力顯著增強。蛋白質表面疏水性分別增加49.13%和52.39%，而溶解性分別減少20.4%和25.56%。蛋白質內部結構的變化對干腌牛肉品質和營養特性產生不同程度影響，這為深入干腌牛肉品質機理的研究提供參考依據，有利于該產品工業化、規模化的發展進程。