牛乳中原生低聚半乳糖的酶法合成及響應面優化

羅俊溢，武倫瑋，付永剛，巴根納，韓仁嬌 ，金麗娜

1.內蒙古伊利實業集團股份有限公司（呼和浩特 011500）；2.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司（呼和浩特 010110）；3.國家乳業技術創新中心（呼和浩特 010110）

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide，GOS）是在乳糖分子的半乳糖基側以β-糖苷鍵的形式連接1~7個半乳糖基形成的混合雜聚糖[1-4]。現代醫學及營養研究表明，食用GOS后會刺激腸道益生菌（以乳酸菌和雙歧桿菌為主）的增殖，腸道益生菌菌株比例增加后，則會抑制腸道有害菌群的增長，并起到調節機體免疫反應和調節機體代謝產物的結構及組成等作用[5-6]，進一步可實現改善機體對礦物元素的吸收[7]、便秘的預防和改善[8]、肥胖的預防和改善[9]、齲齒的預防[10]、血清膽固醇水平的降低[11]甚至腫瘤的防治[12]等對人體健康能產生積極影響的功能。因此將GOS的研究運用到新食品的開發具有重要意義。

經過提純后的GOS的外觀通常為半透明的微黃色或者無色，黏度較低、甜度約為蔗糖的25%，在酸性環境下穩定性好，對熱的穩定性也較高，口感和品質均較為優異[13-14]?，F階段關于GOS的提取或制備方式主要有4種：一是天然分離法，主要從食品原料中直接分離出GOS，但是食品中的GOS通常表現為電中性，對其有效分離較難[14-15]；二是水解法，主要通過對多糖進行水解，并提取水解產物中低聚糖，但多糖的成分相對復雜，其水解產物多樣、結構復雜，以致GOS的轉化率通常不高，難以獲得含量較高的GOS產品[16]；三是化學合成法，通過有機合成原理制備GOS，但是該法通常存在提取試劑毒性較大，且合成的低聚糖類混合物中的α-或β-鍵的結構缺乏特異性等缺點，使其很難大量運用于食品加工業中[17-18]；四是酶法合成，主要通過一種特異性的β-半乳糖苷酶將乳糖轉化為GOS，該酶可以特異性地催化乳糖末端的非還原性的β-d-半乳糖苷單元，使其水解為半乳糖苷，同時催化糖苷配基部分之間的糖苷鍵的水解并產生葡萄糖苷，通過乳糖的半乳糖基化反應催化GOS化合物的合成[19-20]。酶法合成GOS的優點在于反應溫和、安全、高效，且不會產生有害副產物，因此非常適合將其直接運用于食品加工產業中，同時現已經商業化的GOS就是以乳糖為底物通過酶法合成所得。

對于新型酸奶的工業化生產，通常遇到的一個主要問題是若涉及新工藝的引入，其可能會促成較大的設備改造投入，給企業經營造成負擔，如果需要利用牛奶中的乳糖通過酶的作用自合成GOS并做成酸奶，一般有2條途徑：一是在牛奶的配料階段加入酶進行合成，在這個階段若需要達到合適的GOS產量，則需要多加一個酶解罐，增加產品生產投入；二是需要在牛奶的發酵階段加入，但是一般酸奶的發酵時間在5 h左右，因此需要了解為了達到宣稱含量[膳食纖維（以低聚半乳糖計）≥1.5%]的底物含量、酶添加量和酶解時間的基本關系，以更好地將其用于指導工業生產。

以牛乳中的乳糖為研究對象，通過酶法直接將牛乳中的乳糖合成為GOS，探究41 ℃條件下底物濃度、β-半乳糖苷酶添加量和反應時間對GOS產率的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

β-半乳糖苷酶（來源兩歧雙歧桿菌，杜邦公司）；牛奶（內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；乳糖（來源牛奶，荷蘭菲仕蘭公司）；淀粉葡萄糖苷酶、麥芽二糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、乳糖標準品（HPLC≥98%）、氰基硼氫化鈉：均為Sigma公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、二甲基亞砜（色譜純）：均為天津市永大化學試劑有限公司；甲酸銨、甲酸、2-氨基苯甲酰胺（均為上海安普有限公司）；乳酸（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；BSA223S分析天平[賽多斯科學儀器（北京）有限公司]；PB-10 pH儀[賽多斯科學儀器（北京）有限公司]；EYELAN-1100旋轉蒸發儀、EYELAOSB-2100油浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）；Sorvall ST8離心機（美國賽默飛公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛奶中GOS含量的檢測方法確立

參考文獻[21-24]的方法，使用熒光標記-酶識別-高效液相色譜法定量測定牛奶中的GOS含量。

1.3.2 初始乳糖濃度對合成GOS的影響探究

牛乳中初始乳糖濃度分別設定為5.0%，5.5%，6.0%，6.5%和7.0%，將其高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，加入0.1%β-半乳糖苷酶用于合成GOS，待反應3 h后滅酶（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.3β-半乳糖苷酶添加量對合成GOS的影響探究

設定牛乳中的乳糖含量7.0%，高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，分別添加0，0.05%，0.1%，0.15%和0.2%β-半乳糖苷酶，待反應3 h后做滅酶處理（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.4 反應時間對合成GOS的影響探究

設定牛乳中的乳糖含量7.0%，高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，添加0.1%β-半乳糖苷酶，待分別反應1，2，3，4，5，6和7 h后做滅酶處理（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.5 牛奶中GOS合成的響應面法優化與驗證

在單因素試驗的基礎上，以初始乳糖濃度、β-半乳糖苷酶添加量和反應時間為響應變量，分別用A、B、C表示，以GOS含量（Y）為響應值，通過響應面分析，完成酶解合成GOS的優化，選取優化結果予以驗證預測值和實際值的差距。

1.4 數據分析

試驗數據采用Origin、Excel、Design-Expert軟件進行處理及作圖，使用SPSS軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 初始乳糖含量對GOS合成的影響

不同初始乳糖含量的牛乳在41 ℃酶解條件下對GOS合成的影響如圖1所示。隨著牛乳中初始乳糖含量的提高，GOS的合成量也隨之上升，說明底物濃度對酶的水解效率呈正相關。牛乳中的初始乳糖含量大于6.5%時，GOS的合成速率減慢，說明在該酶濃度條件下，酶解效率逐漸接近飽和；而在初始乳糖含量6.0%~6.5%時，GOS的合成增長速率最快，說明在此區間酶的作用條件較適宜。同時考慮最終合成的GOS含量需要在1.5%以上及存在±0.2%的檢測誤差，進一步結合生產成本考量，選取初始乳糖含量5.5%，6.1%和6.7%作為響應面的優化設計值。

圖1 初始乳糖含量對GOS合成的影響

2.2 β-半乳糖苷酶添加量對GOS合成的影響

41 ℃條件下不同β-半乳糖苷酶添加量對牛乳中β-半乳糖苷酶的酶解合成GOS效率方面的影響如圖2所示。β-半乳糖苷酶添加量0時，GOS合成量為0，說明牛乳中的乳糖在該溫度下自然水解無法形成GOS。β-半乳糖苷酶添加量0.05%時，GOS的合成量較少，β-半乳糖苷酶添加量0.10%時，相對于0.05%添加量，GOS合成量有明顯的提高，說明酶對GOS合成量的影響是一個主要因素，當添加量0.15% GOS時合成量達到最大，而β-半乳糖苷酶添加量0.20%時，GOS合成量降低，分析原因是β-半乳糖苷酶添加量過多，同時該酶也會特異性地催化GOS末端的非還原性的β-d-半乳糖苷單元，使其水解為半乳糖苷，同時催化糖苷配基部分之間的糖苷鍵的水解并產生葡萄糖苷，進一步隨著底物含量越來越少，GOS的合成速率會逐漸低于GOS的分解速率，從而導致宏觀檢測GOS含量的減少。結合生產成本控制考慮，響應面優化中β-半乳糖苷酶添加量選擇0.05%，0.10%和0.15%。

圖2 β-半乳糖苷酶添加量對GOS合成的影響

2.3 酶解時間對GOS合成的影響

不同酶解時間對GOS合成的影響如圖3所示。隨著酶解時間的延長，牛乳中GOS的合成量也在不斷提高，酶解時間在前2 h，牛乳中的GOS含量增長緩慢，說明前2 h酶的狀態處于一種活化的狀態，分解效率不高。但在酶解3~4 h，GOS的合成速率有較明顯提升，說明此時酶的活化已完成，且酶解效率也能達到最大，但酶解達5 h后，GOS的合成速度減慢，分析原因是此時剩余的底物不足以支持酶的高效作用。酶解時間7 h時，GOS合成量出現降低，說明此時的底物不夠合成GOS，同時酶對GOS的分解速率大于其合成速率?？紤]酶解時間在5 h后變化趨勢較小，從第3小時開始GOS含量達1.5%左右，因此重點研究3~5 h過程中GOS含量的變化情況。

圖3 酶解時間對GOS合成的影響

2.4 響應面優化牛乳中GOS的合成

2.4.1 試驗模型建立與顯著性檢驗

通過單因素試驗，確定按乳糖含量（A）、β-半乳糖苷酶添加量（B）、酶解時間（C）三因素三水平進行試驗，Box-Behnken試驗設計因素和水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗設計因素和水平

表2 響應面試驗設計及結果

以GOS含量（Y）為響應值，利用SPSS軟件對試驗數據進行分析，得到擬合方程：Y=2.234+0.187 5A+0.566 3B+0.176 3C+0.105AB-0.02AC-0.107 5BC+0.061 8A2-0.220 8B2-0.034 3C2。

對回歸模型進行進一步的顯著性檢驗，結果見表3。模型的F值為37.893 8（P＜0.000 1），表明整體模型達到顯著，FLackoffit值為0.989 5（P=0.482 675），失擬結果不顯著，說明不確定因素對試驗結果的干擾較小。模型中R2=0.979 8，Radj2=0.954 0，表明該模型可以很好地解釋GOS合成量的變化，即該模型的擬合度良好，可用于描述GOS合成量與乳糖含量、β-半乳糖苷酶添加量、酶解時間之間的關系。由表3還可以得出，因素A（乳糖含量）和C（酶解時間）對牛乳中GOS合成含量達到顯著水平，因素B（β-半乳糖苷酶添加量）對牛乳中GOS合成達到極顯著水平。乳糖含量、β-半乳糖苷酶添加量及酶解時間對牛乳中GOS的合成影響順序為β-半乳糖苷酶添加量＞乳糖含量＞酶解時間。該試驗所建立的模型中A和B、B和C及A和C之間的交互影響均不顯著。此外，B2對GOS合成的影響達到顯著水平，而A2與C2對GOS合成率的影響不顯著。

表3 響應面分析結果及顯著性檢驗

2.4.2 響應面分析

利用Design-Expert軟件對試驗數據進行二元多次回歸擬合，交互作用的等高線及響應曲面如圖4所示，通過對比分析3組圖中的曲線的平滑與陡峭程度，可以直觀看出各因素之間的交互作用對GOS合成量的影響。從圖4（a）可以看出，β-半乳糖苷酶添加量對牛乳中GOS合成量的影響大于牛乳中的乳糖含量。從圖4（b）可以看出，β-半乳糖苷酶添加量對牛乳中GOS合成量的影響大于酶解時間。從圖4（c）可以看出，乳糖含量和酶解時間對牛乳中GOS合成量的影響不明顯。這與方差分析結果相吻合。

圖4 響應曲面圖

2.4.3 最佳工藝條件的預測與檢驗

通過Design-Expert軟件預測出牛乳中原生GOS合成的最佳工藝參數：牛乳中的乳糖含量6.12%、β-半乳糖苷酶添加量0.082%、酶解時間4.2 h，在此條件下GOS合成量為2.12%。鑒于工藝的可操作性，將其調整為乳糖含量6.0%±0.2%，β-半乳糖苷酶添加量0.09%±0.01%，酶解時間4.5±0.5 h。經驗證試驗，在此條件下牛乳中GOS合成量達2.07%±0.15%。

3 結論

通過單因素試驗和響應面分析法中的Box-Behenken中心組合方法，得到理論最佳工藝，對酶法合成低聚半乳糖的配方工藝進行優化，并很好地證明模型的可靠性。其中，最佳響應優化理論值為牛乳中的乳糖含量6.12%、β-半乳糖苷酶添加量0.082%、酶解時間4.2 h，理論合成量為2.12%。為增強工藝的可操作性，經微調后得到最適酶法合成GOS的工藝條件：加酶量0.09%±0.01%、牛乳中初始乳糖含量6.0%±0.2%、反應時間4.5±0.5 h。在此條件下，GOS合成量達2.07%±0.15%。其中各因素對GOS合成量的影響順序為β-半乳糖苷酶添加量＞乳糖含量＞酶解時間。通過對41 ℃溫度下酶法合成GOS的配方工藝優化的基礎探究，有助于在真實發酵環境下，對于酶法合成GOS的酸奶開發提供必要的指導和參考。