基于益生菌發酵的甘蔗汁濃縮工藝

聶梅，黃清鏵，胡彪，王慶福，梁磊

廣東省科學院生物與醫學工程研究所，廣東省植物纖維綜合利用工程技術研究開發中心，廣東省生物質高值化利用工程實驗室，廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，藥食同源崖柏精油產業化研究工程中心，特色農產品深加工產業創新基地（廣州 510316）

甘蔗是溫帶和熱帶農作物，其味甘、性寒，歸肺、胃經；具有清熱解毒、生津止渴、和胃止嘔、滋陰潤燥等功效；主治口干舌燥，津液不足，小便不利，大便燥結，消化不良，反胃嘔吐，呃逆，高熱煩渴等[1]。甘蔗中含有豐富的糖分、水分，還含有各種維生素、脂肪、蛋白質、有機酸、鈣、鐵等物質。現代醫學表明，甘蔗具有較強的抗炎、抗氧化、降血糖、正向調節血脂水平等功效[2-5]。近年來甘蔗產業面臨諸多瓶頸問題，如蔗糖產能下降市場行情低迷，全球蔗糖產業普遍不景氣，缺乏精深加工鏈等，甘蔗深加工成為國內外近年來加工研究的熱點。甘蔗汁營養豐富，含有微生物生長所需的所有營養成分，是良好發酵原料，蔗汁經發酵加工后可制備功能飲料、果酒、果醋等產品[6-8]，不僅拓寬甘蔗深加工多樣化產品開發，還豐富發酵飲品品種類型。

試驗前期利用復合益生菌協同發酵技術，發揮微生物協同效應，優化飲品風味，生產兼具保健功能和獨特風味的高端功能飲品[9-11]。但是由于甘蔗汁具有季節性，這制約著甘蔗汁發酵飲品的生產。為突破甘蔗汁原料的局限性，以甘蔗濃縮汁或紅糖為原料，經過復原后評價其發酵性能。由于市面上部分甘蔗濃縮汁添加抗菌成分，這導致復原蔗汁發酵性能受到影響，紅糖加工過程經過高溫熬煮等工藝，復原后紅糖水與甘蔗汁差異較大，顯著影響發酵性能。因此以甘蔗復原果汁的抗氧化活性和總酚含量為指標，研究甘蔗汁的濃縮工藝，以及濃縮蔗汁復原后的發酵性能評價，以期得到發酵性能良好的甘蔗濃縮汁，解決甘蔗果汁受季節性影響的局限性問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮甘蔗（廣東省科學院生物與醫學工程研究所甘蔗種植基地）；植物乳桿菌；酵母菌；醋酸菌；沒食子酸、蘆丁、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等分析標準品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、醋酸鉀、碳酸鈉，福林酚等（均為分析純試劑）。

1.2 方法

1.2.1 黃酮含量測定

黃酮含量參照SN/T 4592——2016《出口食品中總黃酮的測定》，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.41x+0.030 6，R2=0.99。樣品處理：將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物一致（13.8%）后，按標準曲線方法進行總酚含量測定。

1.2.2 總酚含量測定

總酚含量參照團體標準T/AHFIA 005——2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定》，并做相應修改。準確吸取沒食子酸標準儲備液，用60%乙醇溶液配制成質量濃度為0，20，50，100，200和300 mg/L的沒食子酸工作液。分別移取1.0 mL沒食子酸工作液于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，加水定容至刻度，搖勻，在40 ℃水浴60 min，測定其吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.005 7x+0.105，R2=0.996。樣品處理：將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致后，按標準曲線方法進行總酚含量測定。

1.2.3 抗氧化活性評價

1.2.3.1 DPPH自由基清除率

將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的樣品加水至1.0 mL，與1.0 mL 0.4 mmol/L DPPH溶液、2 mL 60%乙醇混合均勻，室溫下靜置30 min，測定波長517 nm處的吸光度Ai。以等體積無水乙醇代替DPPH溶液測定樣品本底吸光度Aj，以等體積蒸餾水代替樣品溶液測定空白對照吸光度A0。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.2.3.2 ·OH自由基清除率

將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的樣品加水至1.0 mL，加入2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 1.0 mmol/L H2O2溶液、2.0 mL蒸餾水、2.0 mL 1.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻，室溫下靜置30 min，測定波長510 nm處的吸光度Ai，以等體積蒸餾水代替H2O2溶液測定樣品本底吸光度Aj，以等體積蒸餾水代替多糖樣品溶液測定空白對照吸光度A0。按式（1）計算·OH清除率。

1.2.3.3 還原力

通過鐵氰化鉀法對還原力進行測定。將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL樣品加水至1.0 mL，與1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液、1.0 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液混合均勻，在50 ℃水浴反應20 min，加入2.0 mL 10%三氯乙酸，按3 000 r/min離心10 min，取2.0 mL上清液加入2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.3%三氯化鐵，混合均勻，在50℃水浴反應10 min，測定700 nm波長處的吸光度A1，以等體積蒸餾水代替三氯化鐵溶液測定空白對照吸光度A2，還原力=A1-A2。

1.2.4 單因素試驗

新鮮的甘蔗，洗凈，榨汁，經孔徑0.48 mm濾網過濾，以去除較大顆粒，獲得的甘蔗果汁在真空度0.05 MPa下進行真空濃縮。研究不同濃縮溫度、濃縮轉速和濃縮產物可溶性固形物含量對濃縮汁總酚含量和DPPH自由基清除率的影響。各因素參數分別為濃縮溫度（50，60，70，80和90 ℃）、轉速（30，40，50，60和70 r/min），濃縮汁可溶性固形物含量（40%，50%，60%，70%和80%）。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9(33)正交試驗設計，以黃酮含量（Y1）、總酚含量（Y2）和抗氧化活性（Y3）為綜合評價指標，因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

采用甘蔗汁濃縮產物的總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性3個指標綜合加權評分法進行正交試驗分析，由于3個評價指標對甘蔗濃縮汁的貢獻不一樣，因此，將黃酮含量、總酚含量和抗氧化性能的權重系數分別設定為30%，30%和40%，綜合評分=（總黃酮含量/甘蔗濃縮汁最高總黃酮含量）×30%+（總酚含量/甘蔗濃縮汁最高總酚含量）×30%+（清除率/甘蔗濃縮汁最高清除率）×40%，以綜合評分進行統計分析。

1.2.6 甘蔗濃縮汁對益生菌發酵性能的影響

將甘蔗濃縮汁和甘蔗原汁稀釋至可溶性固形物含量8%，pH自然（pH 5.15~5.45），在115 ℃滅菌30 min，即得濃縮汁培養基和原汁培養基。將植物乳桿菌以1%的接種量分別接種濃縮汁和原汁培養基中。植物乳桿菌組置于暗處，在37 ℃靜置發酵12 h，酵母菌置于30 ℃，以120 r/min，振蕩培養12 h。分別在濃縮汁和原汁培養基中添加4%無水乙醇（0.22 μm過濾器過濾除菌），接入1%醋酸菌種子液，在30 ℃，以120 r/min，振蕩培養24 h。通過檢測發酵產物的菌落總數、總酸和抗氧化性能指標，比較甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁的發酵性能。

1.2.7 菌落總數測定

菌落總數測定參照GB 4789.2——2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。其中，植物乳桿菌采用MRS瓊脂培養基涂平板，酵母菌采用YPD瓊脂培養基涂平板，醋酸菌采用醋酸菌培養基涂平板（葡萄糖10 g、酵母粉10 g、碳酸鈣5 g、瓊脂粉20 g、水1 L、pH 5.5）。

1.3 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示，采用Excel計算并作圖。采用SPSS 20.0數據處理軟件系統進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1（A）濃縮溫度對甘蔗濃縮汁抗氧化和總酚含量的影響結果得出，溫度大于60 ℃時，甘蔗濃縮汁的多酚含量和抗氧化活性越來越低，濃縮溫度在50 ℃和60 ℃時總酚含量沒有明顯變化，但是采用50 ℃進行濃縮，濃縮時間顯著延長。由圖1（B）濃縮轉速對甘蔗濃縮汁抗氧化和總酚含量的影響結果顯示，隨著轉速的提高，總酚含量和抗氧化隨之提高，轉速達到60 r/min時，總酚含量最高，抗氧化活性在60 r/min時最好，提高轉速略有所降低。圖1（C）顯示，濃縮汁可溶性固形物含量從40%~80%，按比例復原后蔗汁總酚含量沒有明顯變化，抗氧化活性則在可溶性固形物含量60%時達到最高。因此，根據單因素結果得出，最適濃縮溫度60 ℃、最適濃縮轉速60 r/min、最適濃縮汁可溶性固形物含量60%。

圖1 單因素試驗結果

2.2 正交試驗結果

在單因素的基礎上選取濃縮溫度、濃縮轉速、濃縮汁可溶性固形物含量3個因素，采用濃縮汁產物復原到原甘蔗汁可溶性固形物含量一致的黃酮、總酚含量和DPPH抗氧化活性評價3個指標綜合加權評分法進行正交試驗分析。由表2可知，綜合評分最高的組合是A2B3C3，即濃縮溫度60 ℃、轉速70 r/min、濃縮汁可溶性固形物含量70%。由極差可以看出，因素A濃縮溫度的極差最大是主要影響因素，其次是因素C可溶性固形物含量，因素B濃縮轉速影響最小，故各因素對甘蔗濃縮汁綜合評分的影響程度依次為A＞C＞B。由表3方差分析可知，濃縮溫度對甘蔗濃縮汁綜合評分有顯著影響（P＜0.05），濃縮轉速與濃縮汁可溶性固形物對評分沒有顯著性差異。這可能是因為溫度對抗氧化成分包括VC、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）含量及活性變化影響較大[12]而導致。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

2.3 濃縮汁與甘蔗原汁成分比較

根據正交試驗結果，采用最優工藝，即濃縮溫度60 ℃、轉速70 r/min、濃縮至可溶性固形物含量70%，將濃縮汁和甘蔗汁稀釋至可溶性固形物含量為8%，比較濃縮汁和甘蔗汁的成分含量及抗氧化活性，結果如表4所示。甘蔗濃縮汁的總黃酮含量比較高，但是總酚含量卻低于甘蔗汁。抗氧化活性結果顯示，濃縮汁對DPPH自由基的清除率顯著高于甘蔗汁，而羥自由基的清除能力和還原力卻無明顯差異。經過濃縮加工后，濃縮汁的抗氧化活性高于甘蔗汁，可能是甘蔗汁在濃縮過程糖類與氨基酸發生美拉德反應，得到抗氧化活性較強的美拉德反應產物[13]。

表4 濃縮汁與甘蔗原汁成分與抗氧化性能比較結果

2.4 益生菌發酵性能評價

將經過益生菌發酵后發酵產物10倍系列稀釋后，將一定濃度的稀釋液定量地接種到瓊脂平板培養基上培養48 h，計算菌落總數，結果如表5所示。甘蔗濃縮汁和甘蔗原汁發酵植物乳桿菌活菌總數分別為（2.71±0.13）×1010CFU/mL和（2.65±0.09）×1010CFU/mL；酵母菌存活數分別為（2.33±0.07）×108CFU/mL和（2.36±0.09）×108CFU/mL；醋酸菌存活數分別為（4.21±0.15）×107CFU/mL和（4.17±0.19）×107CFU/mL。通過統計發現甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁對益生菌的發酵性能沒有顯著性差異，說明該工藝濃縮得到的甘蔗濃縮汁可替代甘蔗原汁進行益生菌發酵。

表5 濃縮汁與甘蔗原汁發酵性能評價

3 結論

采用甘蔗汁濃縮產物的總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性3個指標綜合加權評分法進行正交試驗分析優化，確定最佳提取條件：濃縮溫度60 ℃、轉速70 r/min、濃縮汁可溶性固形物含量70%。此工藝得到的濃縮汁按比例復原后，其總黃酮含量比甘蔗原汁高，但是總酚含量卻低于甘蔗汁，濃縮汁對DPPH自由基的清除率顯著高于甘蔗汁，而羥自由基的清除能力和還原力卻無明顯差異。通過統計發現甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁對益生菌的發酵性能沒有顯著性差異。該方法為甘蔗汁發酵產業提供原料支撐，為進一步開發功能性益生菌發酵果蔬產品提供保障。