毛霉菌菌絲體多糖的提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性

王顏天池，史紅軍，張紅，吳連平

南京市高淳人民醫(yī)院（南京 211399）

多糖是由10個(gè)以上的單糖分子以糖苷鍵呈線性或分支連接形成的含醛基或酮基的高分子聚合物，普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物等生物體中，是生命活動(dòng)的四大基本物質(zhì)之一[1]。真菌多糖是從真菌的子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中分離得到的多糖，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種生物活性，且毒副作用低，產(chǎn)量高。真菌多糖已在臨床上廣泛應(yīng)用，具有重要的藥用價(jià)值，尋找具有生物學(xué)活性的真菌多糖具有重要意義[2]。

毛霉菌（Mucorsp.）屬于真菌門(mén)接合菌亞門(mén)，是一種絲狀真菌，以孢囊孢子和接合孢子繁殖。毛霉菌廣泛分布于自然界，為腐生性真菌，能夠引起食物霉變，可以分解蛋白質(zhì)，常用于食品工業(yè)[3]。尚無(wú)文獻(xiàn)對(duì)毛霉菌菌絲體多糖（MPS）進(jìn)行相關(guān)報(bào)道，故文章利用單因素試驗(yàn)考察提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比對(duì)菌絲體多糖產(chǎn)量的影響，利用正交試驗(yàn)研究MPS的最佳提取條件[4]。同時(shí)，文章檢測(cè)多糖對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基的清除活性，評(píng)價(jià)其抗氧化活性；利用CCK-8法檢測(cè)MPS對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，從而為毛霉菌菌絲體多糖產(chǎn)量的提高和生物活性的研究提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CICC 3039毛霉菌（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；人肝癌HepG2細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室）；蒽酮、硫酸、果糖（福晨化學(xué)試劑有限公司）；CCK-8、羥自由基測(cè)試試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS）、DPPH（南京建成生物工程研究所）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國(guó)Gibco公司）；青霉素、鏈霉素、磷酸鹽（北京索萊寶科技有限公司）；所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋[世博（青島）畜牧設(shè)備有限公司]；ML104電子分析天平（常州梅特勒托利多集團(tuán)）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州華辰儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水多用真空泵（河南益源儀器有限公司）；SL4F離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）；3503-2二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)SHEL.LAB公司）；XB.K.25.血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲體多糖的提取

菌種接種于馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基中，于28 ℃活化72 h，挑取邊緣菌絲接入液體培養(yǎng)基，于28 ℃，以120 r/min的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。經(jīng)四層紗布過(guò)濾發(fā)酵液收集菌絲體，菌絲體在沸水中浸提3次，將浸提液減壓濃縮至適當(dāng)體積，冷卻后加入四倍體積乙醇[5]。靜置過(guò)夜后，離心收集沉淀，沉淀復(fù)溶后離心收集上清液，用Sevag法（V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1）去除蛋白質(zhì)，減壓濃縮去除有機(jī)試劑，利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，透析后冷凍干燥得到粗多糖[6]。用硫酸蒽酮法檢測(cè)總糖含量[7]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

取1.000 g菌絲體粉末，固定提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）對(duì)MPS提取率的影響；固定提取時(shí)間2 h、料液比1∶30（g/mL）、提取次數(shù)2次，考察提取溫度50，60，70，80和90 ℃對(duì)MPS提取率的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)2次，考察提取時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h對(duì)MPS提取率的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h，考察提取次數(shù)1，2，3，4和5次對(duì)MPS提取率的影響[8-9]。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)法L9(33)優(yōu)化提取工藝，研究影響因素，確定最佳提取條件，水平和因素見(jiàn)表1。

1.3.4 菌絲體多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 MPS對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

稱取適量MPS溶解于2 mL 90%的DPPH溶液中，充分振蕩混勻，使多糖質(zhì)量濃度分別調(diào)整至1，2，3，4和5 mg/mL，在室溫下避光放置30 min，按10 000 r/min離心20 min，在波長(zhǎng)517 nm處檢測(cè)上清液的吸光度，清除率按式（1）計(jì)算。

式中：As為樣品管吸光度；A0為樣品本底吸光度；Ac為空白對(duì)照組吸光度[10]。

1.3.4.2 MPS對(duì)ABTS、羥自由基清除活性的測(cè)定

利用ABTS、羥自由基檢測(cè)試劑盒測(cè)定MPS對(duì)ABTS和羥自由基的清除活力，多糖溶液配制方法同上，以等體積去離子水代替樣品檢測(cè)空白對(duì)照組吸光度，以等體積去離子水代替工作液檢測(cè)樣品本底吸光度，清除率計(jì)算同1.3.4.1。

式中：As為樣品管吸光度；A0為樣品本底吸光度；Ac為空白對(duì)照組吸光度[11-12]。

1.3.5 菌絲體多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，密度為6 000個(gè)/孔，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。稱取適量菌絲體多糖溶解于DMEM培養(yǎng)基中，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入至96孔板中，使多糖質(zhì)量濃度調(diào)整至0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，孵育1.5 h后在A450處測(cè)定吸光度[13]。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)值資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯著性差異用*P＜0.05，**P＜0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)菌絲體多糖（MPS）提取率的影響

如圖1所示，菌絲體多糖的得率隨著料液比中液體占比的增加而顯著增加，當(dāng)料液比等于1∶40（g/mL）時(shí)，多糖得率最高，隨后降低。溶劑體積的增加，有利于多糖的擴(kuò)散。但提取溶劑的體積過(guò)高時(shí)，會(huì)影響浸提體系的傳熱和傳質(zhì)，不利于多糖的提取[14]。

2.1.2 提取溫度對(duì)菌絲體多糖提取率的影響

如圖2所示，當(dāng)溫度為50~80 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌絲體多糖的提取率也逐漸增加。在提取溫度為80 ℃時(shí)，提取率為17.825%。當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸降低。當(dāng)提取溫度升高時(shí)，多糖分子的熱運(yùn)動(dòng)加速，有利于多糖分子的擴(kuò)散。但溫度過(guò)高時(shí)，多糖分子熱不穩(wěn)定，會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致提取率降低[15]。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)菌絲體多糖提取率的影響

由圖3可知，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，提取率為17.10%。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)菌絲體多糖提取率的影響

由圖4可知，多糖提取率隨提取次數(shù)的增加先增加后降低，在提取次數(shù)為3次時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，提取率為16.44%。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)探討了MPS提取條件的最佳范圍，以提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過(guò)表2中多糖提取率的極差分析結(jié)果表明，影響MPS提取率的因素依次是料液比＞提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間，通過(guò)k值比較可知，kA1＞kA3＞kA2，kB3＞kB2＞kB1，kC2＞kC3＞kC1，kD2＞kD1＞kD3，即MPS提取的最佳組合為A1B3C2D2，故MPS的最佳提取條件為料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間2 h，提取溫度為80℃，提取次數(shù)2次，MPS提取率為18.24%。

2.3 MPS體外抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 MPS對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

如圖5所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除率也逐漸增加。當(dāng)MPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為42.76%，但低于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖5 MPS對(duì)DPPH自由基的清除活性

2.3.2 MPS對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

由圖6可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，ABTS自由基的清除活性隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)菌絲體多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除率為40.59%。因此，菌絲體多糖對(duì)ABTS自由基具有一定的清除活性，但是低于陽(yáng)性對(duì)照。

圖6 MPS對(duì)ABTS自由基的清除活性

2.3.3 MPS對(duì)羥自由基清除活性的測(cè)定

如圖7所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，MPS對(duì)羥基自由基的清除活性隨著濃度的增加而增大，當(dāng)MPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率為42.76%。因此，MPS對(duì)羥基自由基具有一定的清除活性，但是低于VC。

圖7 MPS對(duì)羥自由基的清除活性

2.4 毛霉菌菌絲體多糖對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

由圖8可知，MPS與HepG2細(xì)胞孵育24 h后，對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖8 MPS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出MPS最佳提取條件：料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間2 h，提取溫度80 ℃，提取次數(shù)2次，此時(shí)MPS提取率為18.24%。MPS對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基有一定的清除活力，其在5 mg/mL時(shí)對(duì)三種自由基的清除率分別為42.76%，40.59%和42.76%，表明MPS具有一定的抗氧化活性。采用CCK-8法檢測(cè)了MPS對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示MPS對(duì)肝癌細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。此研究對(duì)MPS的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，明確了該多糖的最佳提取條件，并發(fā)現(xiàn)MPS具有一定的抗氧化活性[16]。文章為MPS開(kāi)發(fā)為功能食品或者保健品奠定了基礎(chǔ)，為藥用真菌多糖資源的研究提供了數(shù)據(jù)支持[17-18]。