增強(qiáng)記憶的元寶楓籽油DHA凝膠糖果及機(jī)制研究

古敏晴 ，李楚潔 ，李飛飛 ，肖盼盼 ，王新文, ，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫(yī)藥技術(shù)研究院（深圳 518000）；2.深圳華泓海洋生物醫(yī)藥有限公司（深圳 518000）；3.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

酒精濫用和酒精依賴嚴(yán)重影響人類健康和生活。全球每年因酒精死亡的人數(shù)有330多萬(wàn)人[1]。研究發(fā)現(xiàn)酒精能夠造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)和記憶損傷[2]。酒精引起的這些癥狀與神經(jīng)炎癥有關(guān)[3-4]，可能是通過(guò)Toll樣受體-4（TLR-4）激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)核因子kappa-κB（NF-κB）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）[5-6]。因此，通過(guò)開發(fā)一款具有抗神經(jīng)炎癥的安全有效的食源性功能產(chǎn)品，對(duì)患者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，以改善記憶，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

元寶楓為槭樹科的落葉喬木，元寶楓籽油的神經(jīng)酸含量在5%以上[7]，是一種新資源食品。神經(jīng)酸是一種促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、再生和維持所需的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8-9]。元寶楓籽油是神經(jīng)酸的主要商業(yè)來(lái)源[10]。二十二碳六烯酸（DHA）是在海產(chǎn)品，如深海魚油、藻油中發(fā)現(xiàn)的最重要的n-3 PUFA之一；DHA缺乏與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)之間也存在聯(lián)系，如焦慮[11]、學(xué)習(xí)障礙[12]和認(rèn)知障礙[13]。酸棗仁提取物廣泛應(yīng)用于中藥，已被證明對(duì)治療失眠、睡眠問(wèn)題、焦慮和神經(jīng)衰弱有效[14]。

試驗(yàn)以元寶楓籽油、DHA、酸棗仁提取物為原材料，利用體內(nèi)外試驗(yàn)研究三者不同配方對(duì)腦損傷和記憶障礙的改善作用，從而明確主要功效成分及最佳配方，并探究其潛在作用機(jī)理，為預(yù)防和治療酒精誘導(dǎo)的腦損傷和記憶障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

元寶楓籽油（西安百川生物科技有限公司）；DHA（廣州欣和健康科技有限公司）；酸棗仁提取物（南京郎澤生物科技有限公司）；玉米油（金龍魚牌）；競(jìng)品1和競(jìng)品2（購(gòu)自京東）；乙醇（深圳市化試科技有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）；iba-1抗體（北京索萊寶科技有限公司）；異氟烷（江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

水迷宮儀器（XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Epoch+Elx508，美國(guó)伯騰儀器有限公司）；立式光學(xué)顯微鏡（DS-U3，尼康株式會(huì)社）；便攜式多道小動(dòng)物麻醉機(jī)（ZS-MV-IV，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠136只（遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司）。SPF級(jí)動(dòng)物房，每籠飼養(yǎng)小鼠4只，溫度24±2 ℃，濕度50%±10%，12 h光照-黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 主原料及原料配比篩選

1.4.1.1 主原料的提升記憶力效果

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為5組，分別是正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、元寶楓籽油組、DHA組、酸棗仁提取物組。灌胃給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測(cè)驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測(cè)試記憶能力。

1.4.1.2 不同配方的提升記憶力效果

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為7組，具體分組見(jiàn)表1。給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測(cè)驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測(cè)試記憶能力。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)方案

1.4.1.3 最優(yōu)配方與競(jìng)品的提升記憶力效果的對(duì)比

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為5組，分別是正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、最優(yōu)配方組、競(jìng)品1組、競(jìng)品2組。灌胃給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測(cè)驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測(cè)試記憶能力。

1.4.1.4 水迷宮檢測(cè)

方法參考文獻(xiàn)[15]。試驗(yàn)水迷宮為直徑120 cm、高度50 cm的圓柱形裝置，平臺(tái)為直徑12 cm的圓形平臺(tái)，水溫23~25 ℃，平臺(tái)在東北象限（NE），并低于水平面1 cm。每次將小鼠頭朝池壁放入水迷宮中，隨機(jī)放入不同位置。每次訓(xùn)練限定在60 s內(nèi)，若沒(méi)有超過(guò)60 s，記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間，為潛伏期；若超過(guò)60 s，時(shí)間則記錄為60 s。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔30~40 min，共訓(xùn)練5 d。

1.4.2 最優(yōu)配方改善記憶的機(jī)制研究

1.4.2.1 腦切片蘇木精-伊紅（H-E）染色

試驗(yàn)第28天，異氟烷過(guò)量麻醉后犧牲小鼠，取全腦，用4%多聚甲醛固定至少24 h，并用石蠟包埋、切片（4 μm），用H-E染色。使用顯微鏡觀察腦切片，用CASEVIEWER全景掃描軟件拍照。

1.4.2.2 腦組織TNF-α和IL-β含量測(cè)定

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)腦組織中TNF-α和IL-β的水平。所有的檢測(cè)均按照制造商的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2.3 腦切片免疫熒光染色

iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其熒光強(qiáng)度可以顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。石蠟切片與小鼠iba-1抗體孵育。染色切片用顯微鏡觀察，并用CASEVIEWER全景掃描軟件拍照。

1.4.3 營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)

按照GB 17399——2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 糖果》、SB/T 10021——2017《糖果 凝膠糖果》及GB 2762——2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的要求，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用雙尾t-檢驗(yàn)，其中P≤0.05表示差異性顯著。使用GraphPad Prism 7軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 主原料及原料配比篩選

2.1.1 主原料的提升記憶力效果

水迷宮檢測(cè)指標(biāo)中，潛伏期越短，則說(shuō)明其記憶力越好。如圖1所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠第2~第5天學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長(zhǎng)，而元寶楓籽油、DHA和酸棗仁提取物組小鼠第4~第5天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對(duì)照組。說(shuō)明這3種主原料均有提升記憶力的效果，且元寶楓籽油效果相對(duì)較好，故選擇元寶楓籽油為必備功效成分，復(fù)配DHA和（或）酸棗仁提取物，以確定產(chǎn)品功效成分及最佳配比。

圖1 元寶楓籽油、DHA和酸棗仁提取物3種主原料對(duì)乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.1.2 不同配方的提升記憶力效果

如圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠于第1，第3~第5天學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長(zhǎng)，而配方3組小鼠于第1，第3和第5天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對(duì)照組，配方5組小鼠于第1，第3和第4天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對(duì)照組，其余配方效果一般。結(jié)果表明配方3和配方5均有提升記憶力的效果，且配方3效果相對(duì)更好。

圖2 各配方組對(duì)乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.1.3 最優(yōu)配方與競(jìng)品的提升記憶力效果的對(duì)比

分析圖3，從第2天開始到第5天訓(xùn)練期，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長(zhǎng)。與模型對(duì)照組相比，配方3組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著縮短。競(jìng)品1組和競(jìng)品2組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期并沒(méi)有顯著縮短。并且，在第2和第3天訓(xùn)練期，配方3組小鼠記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于競(jìng)品1組小鼠記憶訓(xùn)練潛伏期。說(shuō)明研發(fā)的配方3產(chǎn)品與市售產(chǎn)品相比，在輔助改善記憶力的作用顯著。

圖3 配方3與2款競(jìng)品對(duì)乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.2 最優(yōu)配方改善記憶的機(jī)制研究

2.2.1 腦切片H-E染色

如圖4所示，在正常對(duì)照組中，海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密，未見(jiàn)細(xì)胞丟失。且細(xì)胞呈圓形且完整，細(xì)胞核染色明顯，呈深藍(lán)色。相反，模型對(duì)照組海馬區(qū)有明顯的損傷，CA3區(qū)部分神經(jīng)元丟失，神經(jīng)元核固縮，呈深嗜堿性。這些異常情況可通過(guò)灌胃配方3而得到改善。綜上所述，配方3可以保護(hù)大腦免受酒精損傷。

圖4 配方3組對(duì)海馬CA3區(qū)和大腦皮層區(qū)的影響

2.2.2 腦組織TNF-α和IL-1β含量測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腦組織中促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β的水平顯著升高。但與模型對(duì)照組小鼠相比，配方3可顯著降低TNF-α和IL-1β水平（圖5），說(shuō)明配方3可降低腦內(nèi)炎癥。

圖5 配方3對(duì)小鼠腦內(nèi)TNF-α和IL-1β水平的影響

2.2.3 腦切片免疫熒光染色

iba-1是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，若小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，則提示大腦出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[16]。如圖6所示，乙醇可增加大腦中iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，而配方3可以減少腦中iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，提示該配方可能通過(guò)抑制腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減少腦內(nèi)炎癥。

圖6 配方3組對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

2.3 產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)研發(fā)的元寶楓籽油DHA復(fù)合凝膠糖果進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示（表2），研發(fā)的產(chǎn)品具有品種該有的色澤、形態(tài)、組織，無(wú)外來(lái)雜質(zhì)，且微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款安全的天然功能產(chǎn)品。

表2 產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以元寶楓籽油、DHA、酸棗仁提取物為主要原料，研制一款具有增強(qiáng)記憶力功能的凝膠糖果，且功效優(yōu)于市場(chǎng)流通較好的2個(gè)競(jìng)品，具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，有望成為因酒精導(dǎo)致記憶力下降和有提高記憶力需求的人群的一種安全無(wú)后顧之憂的新選擇。產(chǎn)品可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性和減少炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而提高記憶和學(xué)習(xí)能力，保護(hù)大腦免受酒精損傷和記憶障礙。此配方下研制的產(chǎn)品具有品種該有的色澤、形態(tài)、組織，無(wú)外來(lái)雜質(zhì)，且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。