磁珠快速核酸提取法在南美白對蝦病原檢測中的應用及其性能評價

徐勝威, 葛明峰*, 盧先東, 劉艷紅, 黃一哲, 王雯瓊, 王雪磊, 王建平, 柳 海

磁珠快速核酸提取法在南美白對蝦病原檢測中的應用及其性能評價

徐勝威1, 葛明峰1*, 盧先東2, 劉艷紅2, 黃一哲2, 王雯瓊1, 王雪磊1, 王建平1, 柳 海1

（1.寧波市海洋與漁業研究院, 浙江 寧波 315012; 2.寧波愛基因科技有限公司, 浙江 寧波 315105）

為實現南美白對蝦相關病原核酸快速、便捷提取, 并實現原材料國產化, 降低成本, 建立了一種基于國產磁珠的核酸快速提取方法(以下簡稱磁珠法). 以攜帶蝦肝腸胞蟲的南美白對蝦為實驗樣本, 通過微流控芯片對3種磁珠提取的核酸進行測試, 并對裂解液中鹽酸胍濃度及洗滌液2中乙醇濃度進行了優化. 通過優選實驗確定: 奧潤磁珠提取效果優于其他兩種磁珠; 裂解液中鹽酸胍的最佳濃度為4mol·L-1; 洗滌液2中乙醇的最佳質量分數為75%. 在此基礎上, 分析評價了優化后的磁珠法核酸提取線性范圍、靈敏度、精密度、特異性及抗干擾能力等技術性能. 結果顯示: 稀釋104倍后的低濃度病原核酸仍保持較好的擴增效果, 變異系數為2.03%, 表明建立的磁珠法具有較寬的檢測范圍, 靈敏度高, 特異性和抗干擾能力強. 本文建立的磁珠法可實現快捷、通用、高純度、低成本的南美白對蝦主要病原的核酸提取.

磁珠法; 快速; 核酸提取; 評價

南美白對蝦每年因病害造成的經濟損失較為嚴重, 據《2022中國水生動物衛生狀況報告》[1], 2021年養殖蝦類因疾病造成經濟損失高達90億元, 亟需建立南美白對蝦主要疾病的快速診斷技術, 及時發現病害, 阻斷疫病蔓延, 從而減損增效.

病原檢測技術大部分基于目的核酸片段的診斷, 因此, 有效快速的核酸提取方法尤為重要. 目前常見的核酸提取方法為常規沉淀離心法, 但該方法操作時間長, 裂解不充分, 存在交叉污染等風險, 繼而影響檢測結果的準確性, 且對儀器和操作要求較高, 提取過程中用到的酚、氯仿等有機試劑對操作人員有一定的危害[2-5].

隨著分子生物學技術的快速發展, 近年來, 磁性納米材料在核酸分離中的應用越來越受關注[6]. 磁珠法核酸提取是一項將生物分子技術與納米材料科學相結合的新型技術, 其原理是在外磁場的作用下, 通過細胞裂解出來的核酸分子被特異地吸附到磁性納米顆粒表面, 實現核酸分離純化[7]. 該方法是核酸提取純化領域的一項重大突破, 能從血液、動植物組織、食品、土壤、糞便、唾液等大多數生物組織樣本中分離純化核酸, 并已應用于食品、醫療等領域的病原體快速檢測[8]. 磁珠法克服了傳統核酸提取法操作繁雜、費時等問題, 不需要特殊的分離設備, 避免了反復離心而造成的核酸損失, 可實現快捷、簡便、通用、高純度的核酸提取.

本研究在國內現有磁珠材料和核酸快捷提取方法基礎上, 根據磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測通則[9], 利用針對南美白對蝦病原核酸開發的一種磁珠試劑盒, 通過對試劑盒中磁珠種類、裂解液成分和磁珠洗滌條件等進行優化, 建立了快速提取核酸的方法, 并對優化后磁珠法的線性范圍與靈敏度、精密度、特異性及抗干擾能力等進行了分析評價.

1 材料與方法

1.1 材料

經行標法(SC7232-2020)檢測確認攜帶蝦肝腸胞蟲(EHP)的南美白對蝦采自寧波市南美白對蝦養殖場; 熒光預混液由寧波愛基因科技有限公司提供; 裂解液(管1): 4mol·L-1鹽酸胍、5%吐溫20、10mmol·L-1Tris、5mmol·L-1EDTA; 洗滌液1 (管2): 1mol·L-1鹽酸胍、10mmol·L-1Tris、50%乙醇; 洗滌液2 (管3): 75%乙醇; 洗脫液(管4): TE溶液; 磁珠為硅羥基磁性納米顆粒, 磁珠粒子直徑500nm, 磁珠1購自北京百歐泰生物科技有限公司, 磁珠2購自蘇州北科震澤生物技術有限公司, 磁珠3(產品貨號: GNT-108)購自上海奧潤微納新材料科技有限公司; 其他試劑都為國產分析純; 核酸擴增檢測設備: 愛基因MA2000e微流控核酸檢測儀.

1.2 實驗方法

1.2.1 磁珠法核酸提取

磁珠法核酸提取流程如圖1所示, 操作前將管1、管2、管3和管4放入60℃金屬浴中預熱.

圖1 磁珠法核酸提取流程

裂解: 取5μL磁珠混合液(磁珠和超純水組成, 100g·L-1)和20μL蛋白酶K混合液(20g·L-1)加入管1, 加入200μL準備好的樣本(蝦苗整蝦研磨, 成蝦取鰓、肝胰腺、腸管、肌肉等組織研磨, 將樣品放入勻漿袋加入適量雙蒸水反復擠刮獲得勻漿液)到管1中, 用磁棒套上下振蕩10s后孵育5min. 將磁棒插入到磁棒套中, 放入管1上下抽打10次(10s), 再靜置1min.

清洗: 將磁棒插入管2, 上下快速抽打30次, 然后將磁棒放入管3, 上下快速抽打30次.

洗脫: 將磁棒放入管4, 抽出磁棒留下磁棒套, 上下快速抽打/旋轉20次, 60℃孵育3min, 然后用磁棒套快速攪動20次. 將磁棒插回磁棒套內, 吸取管4內所有磁珠, 再取出磁棒, 管4內液體可直接用于分子檢測.

1.2.2 檢測體系和程序

上樣體系為25μL, 其中熒光預混液10μL, 核酸15μL. 將上述體系置于MA2000e微流控核酸檢測儀于63.5℃下反應60min, 熒光通道設置為FAM.

1.2.3 磁珠篩選

選擇市場上常見的3種磁珠: 磁珠1、磁珠2、磁珠3, 按照1.2.1、1.2.2的方法分別進行測試評估.

1.2.4 裂解液優化

更改管1 (裂解液)鹽酸胍的濃度分別為3.5 mol·L-1(裂解液1)、4mol·L-1(裂解液2)、4.5mol·L-1(裂解液3), 按照1.2.1、1.2.2的實驗過程和方法進行核酸提取和靶基因擴增驗證.

1.2.5 磁珠洗滌條件優化

更改管3 (洗滌液2)乙醇的質量分數分別為65% (洗1組)、75% (洗2組)、85% (洗3組)做同步實驗, 確認管3中最合適的乙醇質量分數.

1.2.6 線性范圍與靈敏度評價

將使用優化后磁珠法提取的已知質量濃度為143.57mg·L-1的樣品核酸作10倍比稀釋, 配制成系列濃度的稀釋液(稀釋倍數: 101～106), 根據擴增曲線確認其靈敏度和線性范圍.

1.2.7 精密度評價

按照優化后的磁珠法對攜帶EHP的原組織樣本進行多次核酸提取, 通過核酸擴增, 測定變異系數(CV).

1.2.8 特異性測試

按照優化后的磁珠法對南美白對蝦常見的白斑綜合征病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)、十足目虹彩病毒1 (DIV1)、偷死野田村病毒(CMNV)、傳染性肌壞死病毒(IMNV)、致急性肝胰腺壞死弧菌(AHPND)、EHP共8種病原樣本(由寧波市海洋與漁業研究院提供)分別進行核酸提取, 并用對應的引物進行檢測, 根據擴增曲線確認特異性.

1.2.9 抗干擾物測試

在攜帶EHP的南美白對蝦樣品中添加常見的乙醇、池塘水、飼料等干擾物, 干擾物與組織樣品的體積比為1:3, 按照優化后的磁珠法提取核酸, 檢測抗干擾能力.

2 實驗結果

2.1 磁珠篩選

使用不同類型的磁珠提取核酸, 根據表1可知, 磁珠1平均起峰時間10.90min; 磁珠2平均起峰時間12.87min; 磁珠3平均起峰時間9.63min. 故選擇磁珠3 (奧潤)作為最佳磁珠.

表1 磁珠篩選實驗數據 min

2.2 裂解液優化

裂解液成分中鹽酸胍的濃度對核酸提取效果影響見表2, 裂解液1平均起峰時間12.42min; 裂解液2平均起峰時間11.84min; 裂解液3平均起峰時間13.79min. 故選擇裂解液2 (鹽酸胍濃度4mol·L-1)為最適裂解液.

表2 裂解液優化實驗數據 min

2.3 磁珠洗滌條件優化

洗滌液2中乙醇的濃度對核酸提取效果影響較大, 由表3可知, 洗1組平均起峰時間14.20min; 洗2組平均起峰時間9.13min; 洗3組平均起峰時間22.10min. 故選洗2組(乙醇質量分數75%)作為最優的磁珠洗滌條件.

表3 洗滌條件優化實驗數據 min

2.4 線性范圍與靈敏度評價

將核酸樣本進行10倍梯度稀釋, 經核酸擴增后的效果見表4, 可見在核酸稀釋104倍后還是可以保持很好的擴增效果, 證明上述優化的磁珠核酸提取法具有良好的線性范圍和靈敏度.

表4 線性范圍和靈敏度測試實驗數據 min

注： “-”表示擴增曲線未起峰.

2.5 精密度評價

按照優化后的磁珠法體系, 對攜帶EHP的組織樣本進行8次重復提取核酸, 每個提取樣本4個平行. 結果表明, 32個反應平均起峰時間為5.98 min, 標準差為0.12min, CV值為2.03%, 證明其具有良好的穩定性(表5).

表5 精密度測試實驗數據 min

2.6 特異性評價

用上述優化磁珠法提取含有8種病原的對蝦組織核酸, 核酸質量濃度分別為103.87mg·L-1(EHP)、96.49mg·L-1(AHPND)、201.58mg·L-1(IHHNV)、220.85mg·L-1(WSSV)、158.64mg·L-1(DIV1)、147.32mg·L-1(TSV)、166.25mg·L-1(CMNV)、189.54mg·L-1(IMNV), 檢測8種病原的核酸擴增曲線. 由圖2可知, 該方法提取的核酸只會引起對應的檢測試劑產生特異性擴增峰, 具有良好的特異性.

2.7 抗干擾物測試

在攜帶EHP的南美白對蝦樣品中添加常見干擾物, 按照優化后的磁珠法提取核酸后進行特異性擴增實驗. 由表6可知, 在樣品中添加常見干擾物后提取核酸, 對之后的檢測未產生明顯影響.

表6 干擾物測試實驗核酸擴增起峰時間 min

圖2 特異性測試實驗結果

3 討論

核酸提取是病原檢測中關鍵步驟之一, 影響核酸提取效果的因素很多, 除了初始樣本量、提取方法外, 還有提取后加入的溶解核酸溶液量. 因此, 選擇一種高效的核酸提取方法對保證核酸檢測結果的快速與準確至關重要. 納米磁珠技術極大地推動了基于磁性微球的核酸自動化提取發展進程, 磁珠法現已逐漸應用于核酸和其他多種生物物質的分離與純化[10]. 在核酸提取中, 磁珠種類、添加劑成分及體系組成等都是影響核酸純化效果的關鍵因素[11], 提取方法的靈敏度、特異性也直接關系到后續實驗的成敗[12]. 目前, 由于提取試劑成分的限制, 運用磁珠法快速提取基因組核酸均針對某一種特定的樣本, 缺乏廣泛適用性[6].

本文以攜帶病原的南美白對蝦為實驗樣本, 介紹了磁珠法核酸提取技術的開發. 目前市面上所銷售的磁珠法試劑盒大多采用國外試劑, 而進口試劑價格昂貴, 在國內基層很難推廣應用[10,13-14]. 通過篩選市面上常見的幾種國產磁珠, 運用本文方法提取核酸, 提純的核酸通過檢測南美白對蝦常見病原, 證明具有較好的擴增效果. 鹽酸胍在核酸提取中起到裂解組蛋白的作用, 它可使氫鍵斷裂, 溶解蛋白質, 從而破壞蛋白質二級結構, 使蛋白質從核酸上解離下來, 核酸分子暴露的磷酸基團與磁珠表面修飾的基團形成氫鍵, 增加DNA的吸附[6]. 許朋等[6]研究發現, 在磁珠法進行小鼠肺組織基因組DNA的提取實驗中, 當鹽酸胍濃度高于4mol·L-1時, 隨濃度的增加電泳條帶也加粗、加亮, 當鹽酸胍濃度高于6mol·L-1后, DNA提取效率呈現飽和趨勢, 增加效果不明顯, 該結論與本研究基本相符, 本方法中選擇鹽酸胍濃度為4mol·L-1時, 核酸提取效果好、效率高.

核酸的提取效率直接影響檢測靈敏度, 核酸的純度和質量與擴增效果密切相關[15]. 王軍等[16]實驗表明磁珠法提取核酸具有較高的靈敏度, 用磁珠法提取新城疫病毒陽性檢出率高達100%, 而柱式法提取核酸檢出率僅為86.36%, 同時還指出磁珠法提取的核酸在病原檢測中具有較好的重復性, 病原檢出率100%. 本實驗提取的核酸(初始質量濃度143.57mg·L-1, 經nano-300微量分光光度計測定)稀釋104倍后仍具有較好的擴增效果, 表明該方法檢測載量的線性范圍良好, 具有較好的檢測靈敏度, 這與畢昊等[15]使用國產磁珠核酸自動提取系統對人巨細胞病毒DNA檢測的性能評價一致. 本研究中, 對攜帶EHP的組織樣本經過8次重復提取核酸后, 32個擴增反應的平均起峰時間僅為5.98min, CV值為2.03%, 證明其具有良好的檢測靈敏度、穩定性和可重復性. 磁珠法試劑使用特異性納米磁珠對核酸進行吸附, 核酸提取效率較高, 操作過程中可實現磁珠的可視化, 防止核酸丟失, 因而實驗結果準確度較高[17].

南美白對蝦病原檢測中干擾物對核酸提取有較大的影響, 主要包括采樣中伴隨樣本的殘餌、池塘水以及用于樣品固定的乙醇. 本實驗模擬以上干擾物質, 在攜帶EHP的南美白對蝦樣本中添加乙醇、池塘水、飼料等干擾物, 干擾物與組織樣品的體積比為1:3, 用優化后的磁珠法提取核酸, 擴增曲線表明加入干擾物組與對照組相比沒有顯著差異, 顯示本方法提取核酸具有良好的抗干擾能力. 鄭瑜宏等[18]研究表明, 磁珠法抗干擾能力較強, 因為磁珠能夠高效吸附核酸, 然后通過洗滌等步驟能有效去除樣本中的干擾物質, 極大地提高了試劑盒的靈敏度, 降低了假陰性率.

本研究通過對磁珠法核酸提取過程中磁珠種類、試劑成分及條件優化, 找到了一種適用于南美白對蝦主要病原檢測的核酸快速提取方法, 該方法12min內可完成核酸提取, 在南美白對蝦主要病原檢測上具有較高的靈敏度、可重復性和特異性, 且無需大型設備, 操作簡單, 為養殖基層實現自檢提供了可靠的技術參考.

[1] 農業農村部漁業漁政管理局, 全國水產技術推廣總站. 2022中國水生動物衛生狀況報告[M]. 北京: 中國農業出版社, 2022.

[2] 劉洪波, 劉曉雷, 羅小銘. 核酸提取方法進展[J]. 現代生物醫學進展, 2011, 11(16):3187-3190.

[3] 查瑤, 王小靈, 朱詩艷, 等. 煮沸裂解法與磁珠法在HBV DNA熒光定量檢測中的核酸提取效果[J]. 浙江預防醫學, 2015, 27(12):1292-1293.

[4] 盧瑛, 劉照關, 徐宏, 等. 一種快速提取基因組DNA的方法[J]. 中國生物工程雜志, 2008, 28(3):69-73.

[5] 高秋月, 景奉香, 李海燕, 等. 基于磁珠的細菌基因組DNA快速提取方法[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(21): 11071-11074.

[6] 許朋, 鄭春輝, 孫智勇, 等. 磁珠法快速提取基因組DNA的實驗研究[J]. 生物信息學, 2018, 16(3):190-195.

[7] Wang J H, Ali Z, Wang N Y, et al. Simultaneous extraction of DNA and RNA fromBL 21 based on silica-coated magnetic nanoparticles [J]. Science China Chemistry, 2015, 58(11):1774-1778.

[8] 曹飛揚, 王娉, 趙曉美, 等. 常見病原菌基因組DNA快速提取試劑盒研制[J]. 東北農業大學學報, 2016, 47(6):81-88.

[9] GB/T 40171—2021. 磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測通則[S].

[10] 陸佳飛, 周科隆, 王縵. 磁珠快速提取乙型肝炎病毒DNA方法的建立及其應用研究[J]. 中華檢驗醫學雜志, 2012, 35(9):843-850.

[11] 王舒婷, 馬振男, 李玲玉, 等. 基于功能化磁珠快速提取植物病毒RNA方法的建立與優化[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2021, 37(1):127-134.

[12] 張翠真, 袁小龍, 陳志和, 等. 基于磁珠的核酸快速提取和純化[J]. 生物學雜志, 2019, 36(4):97-101.

[13] 陸佳飛, 周克隆, 王縵. 磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究及其在診斷試劑中的應用[C]//第五次全國免疫診斷暨疫苗學術研討會論文匯編. 銀川, 2011: 167-171.

[14] 王瑞蓮, 張婷, 龍軍, 等. 國產磁珠法試劑在熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒核酸中的應用[J]. 實用醫學雜志, 2015, 31(21):3594-3596.

[15] 畢昊, 吳嵐, 郭秋, 等. 一種國產磁珠核酸自動提取系統對人巨細胞病毒DNA檢測的性能評價[J]. 臨床血液學雜志, 2020, 33(8):529-533.

[16] 王軍, 何長生, 王維, 等. 磁珠法和柱式法提取核酸在新城疫熒光定量檢測中的比較[J]. 中國動物保健, 2021, 23(3):98; 100.

[17] 張英哲, 宋英蘭. 磁珠法在120例丙型肝炎病毒核酸定量檢測中的應用效果觀察[J]. 延邊大學醫學學報, 2020, 43(3):205-207.

[18] 鄭瑜宏, 鐘鳳金, 陳巖松, 等. 磁珠核酸提取方法在血漿EBV-DNA實時熒光定量PCR檢測中應用的性能評價[J]. 中國醫藥導報, 2017, 14(24):13-16.

Application and performance evaluation of magnetic beads method for rapid nucleic acid extraction in pathogen detection of

Xu Shengwei1, Ge Mingfeng1*, Lu Xiandong2, Liu Yanhong2, Huang Yizhe2, Wang Wenqiong1, Wang Xuelei1, Wang Jianping1, Liu Hai1

( 1.Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute, Ningbo 315012, China; 2.Ningbo iGene Technology Co., Ltd., Ningbo 315105, China )

In order to promote the rapid and convenient extraction of pathogenic nucleic acid related to, and to enable the localization of raw materials and reduce costs, a rapid nucleic acid extraction method based on domestic magnetic beads (magnetic beads method) was developed. In the present study,carryingwas used as the experimental sample. The nucleic acid extracted from three magnetic beads was tested by microfluidic chip, and the concentration of guanidine hydrochloride in the lysate and the concentration of ethanol in the washing solution 2 were optimized. Through the optimization test, it was determined that the extraction effect of Allrun magnetic beads was better than the other two kinds of magnetic beads. The optimum concentration of guanidine hydrochloride in the lysate was 4mol·L-1. The optimum concentration of ethanol in washing solution 2 was 75%. On this basis, the linear range, sensitivity, precision, specificity, and anti-interference ability of optimized magnetic beads method were analyzed and evaluated. The results showed that the low concentration of pathogenic nucleic acid which was diluted 104times still maintained good amplification effect. The coefficient of variation was 2.03%, indicating that the established magnetic beads method produced a wide detection range, high sensitivity, strong specificity and anti-interference ability. The established magnetic beads method can achieve rapid, universal, high-purity and low-cost nucleic acid extraction of the main pathogens of.

magnetic beads method; rapid; nucleic acid extraction; evaluation

S945.4

A

1001-5132（2023）03-0010-06

2023?02?06.

寧波大學學報（理工版）網址: http://journallg.nbu.edu.cn/

寧波市公益類科技計劃（2021S076）.

徐勝威（1983－）, 男, 浙江蘭溪人, 工程師, 主要研究方向: 水生動物病害防控. E-mail: 546207546@qq.com

通信作者:葛明峰（1988－）, 男, 浙江寧波人, 碩士, 主要研究方向: 水生動物病害防控. E-mail: 910342950@qq.com

（責任編輯 韓 超）