P物質通過激活NF-κB誘導人角質形成細胞產生抗菌肽

玫瑰痤瘡(又稱酒渣鼻)是一種較為常見的面部慢性炎癥性皮膚病,該病的發病機制至今仍不完全清楚。遺傳、固有免疫和適應性免疫異常、血管神經功能失調以及蠕形螨等微生物過度定植被認為參與玫瑰痤瘡皮損的發生［1-3］。最近研究發現與正常面部皮膚比較,玫瑰痤瘡患者受累皮膚角質層激肽釋放酶5(kallikrein 5,KLK5)異常增加,使抗菌肽CAMP (cathelicidin antimicrobial peptide)的前體蛋白過度水解生成具有生物活性LL37短肽。因該短肽全長37個氨基酸且N端兩個起始氨基酸為亮氨酸(leucine),故命名為LL37［4,5］。用人工合成的LL37短肽直接注射小鼠背部可造成皮膚出現玫瑰痤瘡樣皮損改變［6］,提示抑制皮膚角質形成細胞產生抗菌肽及其活性蛋白水解物LL37是治療玫瑰痤瘡的關鍵靶點。P物質(Substance P)是一種由皮膚感覺神經釋放的神經肽,可以刺激肥大細胞脫顆粒、角質形成細胞產生促炎因子從而介導皮膚炎癥的發生［2］。多個研究表明玫瑰痤瘡患者皮膚中P物質含量增加［7］。他克莫司(FK-506)作為一種鈣調磷酸酶抑制劑,臨床上可用于改善玫瑰痤瘡患者的癥狀,可能與其免疫抑制功能相關,但具體機制并不十分明確［8］。本研究觀察P物質以及FK-506對培養HaCaT人角質形成細胞產生抗菌肽CAMP的影響及可能的機制,旨在進一步探討P物質在玫瑰痤瘡發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 永生化人表皮角質形成細胞HaCaT細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心;P物質購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號：T510312);FK-506(他克莫司,德國Merck公司);DMEM培養基、PBS、青-鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化酶、Cy3標記山羊抗兔IgG、RIPA裂解液、Trizol試劑(貨號：G3013-100ML)、逆轉錄試劑盒(貨號：G3329-100)、SYBR Green qPCR試劑盒(貨號：G3326-05)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;胎牛血清(德國 PAN 公司);兔抗CAMP抗體(貨號：A155653,ABclonal公司)、兔抗NF-κB p65/RelA抗體(貨號：A11204,ABclonal公司);CFX熒光定量PCR儀 (美國 Bio Rad公司);3300 Mini 熒光化學發光凝膠成像系統(中國勤翔科學儀器有限公司);正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制 P物質用雙蒸水溶解成1 mg/mL母液,分裝-80℃儲存,用完全培養基稀釋至終濃度。

1.2.2 細胞培養與處理 HaCaT細胞接種于含10%胎牛血清和青-鏈霉素的DMEM培養基,置于含5% CO2的37℃培養箱中常規培養。取指數生長期HaCaT細胞接種于6孔板中,將細胞處理分為對照組、P物質組(0.1、1、10和1 μM)、1μM FK-506組、1 μM P物質和1 μM FK-506聯合處理組。藥物處理24 h, 收獲細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照本實驗室建立的方法［9］,用Trizol試劑從處理的細胞提取總RNA,測定樣品A260/280比值判斷核酸純度后逆轉錄合成 cDNA。用SYBR Green熒光定量說明書進行定量檢測。反應條件分別為95℃ 10 min,95℃ 15 s,和60℃ 60 s,共 40次循環。mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。以GAPDH為內參基因。引物由上海生工合成,其上下游引物序列為：CAMP,5-TGACTTCAAGAAGGACGGGC-3’,反向引物5’-CAGGGCAAATCTCTTGTTATCCTTA-3’;GAPDH,5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’,反向引物5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’。

1.2.4 蛋白質免疫印跡 同上收集細胞后,PBS清洗細胞并加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液,100℃變性。取10 μg樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,轉膜、封閉后加入抗CAMP抗體(1∶1000)和抗GAPDH抗體(1∶1000)于4℃孵育過夜。次日洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1000稀釋)室溫孵育1 h。使用ECL化學熒光法顯色。將 PVDF 膜置入熒光化學發光凝膠成像系統觀察攝片,用Image J圖形分析軟件測定條帶的灰度值。以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 細胞爬片制備與免疫熒光染色 取指數生長期HaCaT細胞接種于細胞爬片,隨后,用1 μM P物質處理不同時間(0.5、1、2和4 h)制備細胞爬片。同時用對照組、1 μM P物質、1 μM FK-506、1 μM P物質與1 μM FK-506聯合處理組細胞制備細胞爬片。用4%多聚甲醛固定10 min,冷PBS洗3次,再用0.2% TritonX-100冰上膜滲透處理10 min,冷PBS洗3次。用含有10%山羊血清PBS封閉1 h;滴加抗CAMP抗體(1∶100稀釋)或者抗NF-κB抗體(1∶100稀釋)后于4℃濕盒中孵育過夜。次日,PBS洗3次后滴加Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶100稀釋)于濕盒室溫避光孵育1 h。PBS洗3次,滴加DAPI室溫反應8 min后再次PBS洗3次,抗熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察。使用Image J軟件對熒光染色強度進行檢測。

2 結果

2.1 P物質誘導HaCaT細胞抗菌肽產生和NF-κB/p65核轉位 qRT-PCR實驗結果(圖1a)顯示：與空白對照組相比,0.1～10 μM的P物質處理24 h均可以刺激HaCaT細胞CAMP mRNA表達增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。不同濃度P物質處理HaCaT細胞處理48 h后,各組CAMP mRNA表達較空白對照組均有增加趨勢,只有1 μM P物質處理組具有統計學意義(P<0.05)。處理48 h與處理24 h相比,刺激CAMP mRNA表達效果明顯降低。免疫蛋白印跡實驗結果(圖1b、1c)顯示1 μM P物質處理HaCaT細胞24 h后刺激CAMP蛋白表達增加趨勢最高。故此,本研究選取1 μM P物質處理24 h進行后續實驗。

1a：mRNA表達水平;1b：不同濃度P物質處理24 h后CAMP蛋白表達;1c：蛋白印跡條帶灰度值分析。*：與空白對照組比較,P<0.05;**：與空白對照組比較,P<0.001

免疫熒光染色(圖2a～2e)結果顯示：1μM P物質處理0.5 h后HaCaT細胞出現明顯的NF-κB/p65核轉位,差異具有統計學意義(P<0.05)。而隨P物質處理時間的延長,核轉位現象逐漸減弱,至P物質處理4 h時HaCaT細胞NF-κB/p65核轉位較空白對照組無明顯差異。

2.2 FK-506抑制P物質誘導角質形成細胞NF-κB/p65核轉位及抗菌肽產生 免疫熒光(圖3a～3d)結果表明：1 μM P物質處理0.5 h后HaCaT細胞出現明顯的NF-κB/p65核轉位,FK-506處理后可以抑制P物質誘導的HaCaT細胞NF-κB/p65核轉位,差異具有統計學意義(P<0.05)。FK-506單獨處理HaCaT細胞與空白對照組相比,NF-κB/p65核轉位有減少趨勢,但無統計學意義。

2a：空白對照組;2b～2e：P物質處理后0.5,1,2,4 h組;2f： NF-κB/p65細胞核熒光著色強度百分比。*：與對照組比較,P<0.05

3a：空白對照組;3b：P物質處理組;3c：FK-506處理組; 3d：P物質與FK-506聯合處理組;3e：NF-κB/p65細胞核熒光著色強度百分比。*：與對照組比較,P<0.05

處理細胞用免疫熒光染色顯示胞漿蛋白表達水平,結果(圖4a～4d)顯示：與空白對照組相比P物質可以增強HaCaT細胞CAMP 蛋白的表達,而FK-506可以拮抗P物質對HaCaT的刺激,差異均具有統計學意義(P<0.05)。FK-506處理后HaCaT細胞CAMP 蛋白的表達較空白對照組有下降趨勢,但差異不具有統計學意義。蛋白印跡實驗(圖4e、4f)和qRT-PCR實驗(圖4g)結果表明各處理組對HaCaT細胞表達CAMP蛋白和mRNA的影響與上述結果一致。

4a：空白對照組;4b：P物質處理組;4c：FK-506處理組; 4d：P物質與FK-506聯合處理組;4e：蛋白印跡;4f：蛋白印跡條帶灰度值分析;4g：mRNA表達水平;*：與對照組比較,P<0.05

3 討論

血管舒縮神經紊亂導致短暫性面部潮紅(transient facial flushing)、持續性毛細血管擴張以及炎癥性丘疹、膿皰是玫瑰痤瘡的早期臨床表現［9］,且冷熱刺激、辛辣食物、精神壓力和情緒激動等可誘發加重這些表現［1］。至于神經精神因素如何誘發或加重玫瑰痤瘡的機制尚未闡明。抗菌肽CAMP的產生機制目前尚不完全清楚,Ralph等［10］提出結核分枝桿菌通過Toll樣受體2(TLR2)刺激小鼠巨噬細胞NF-κB核轉位調控VDR表達最終上調LL37的表達;也有研究認為紫外線照射、氧化應激和創傷等外界應激源可以導致細胞內質網應激,經過一系列反應后誘導NF-κB核轉位,調控LL37的表達,提示NF-κB核轉位與抗菌肽CAMP的產生有關［11］。亦有證據顯示表皮角質形成細胞過度產生抗菌肽CAMP及其活性蛋白水解物LL37,后者反式激活核因子NF-κB 信號通路促進炎癥因子釋放［4,11］。此外,人們還觀察到在真皮淺層沿基底膜平行分布著一群感覺神經纖維(元)叢,并向上垂直伸出分支跨過基底膜進入了表皮基底層,這些游離的表皮內神經纖維(intraepidermal nerve fiber)能感知或響應表皮微環境中理化因子的刺激釋放神經肽［12］。這些表皮內無髓鞘的感覺神經纖維在收到刺激后釋放大量神經肽如P物質(又稱作神經激肽1,neurokinin-1)［13］,P物質與角質形成細胞表面的神經激肽1受體(NK1R)結合持續激活了NF-κB信號通路,誘導促炎因子(如IL-1α、IL-6和IL-8等)大量釋放［14］。因此,我們推測當人情緒過于激動時,表皮內感覺神經纖維可能釋放出大量P物質,P物質通過激活NF-κB信號通路誘導角質形成細胞產生抗菌肽CAMP,從而啟動和參與了玫瑰痤瘡慢性炎癥過程。

為了證實上述假說,本研究首先觀察了P物質對體外培養HaCaT角質形成細胞的抗菌肽CAMP產生和NF-κB信號活化(表現為NF-κB/p65核轉位)的影響。結果顯示不同濃度(0～10 M)P物質作用細胞24 h, 抗菌肽CAMP mRNA和蛋白質表達水平明顯增高,1 M P物質處理細胞24 h上調抗菌肽的作用最強;而處理48后上調作用明顯減弱 (圖1)。同時,用免疫熒光染色觀察到1 M P物質處理細胞后不同時間(0.5～4 h)NF-κB/p65核轉位的發生,結果顯示0.5 h后HaCaT細胞明顯出現NF-κB/p65核轉位,而隨著處理時間的延長,核轉位現象逐漸減弱或消失,4 h時HaCaT細胞NF-κB/p65核轉位與空白對照組無明顯差異(圖2)。Azzolina等的研究也顯示SP處理30 min時大鼠肥大細胞細胞核內NF-κB/p65含量最高,隨著處理時間延長,胞核內NF-κB/p65含量下降［15］。

有研究證實鈣調神經磷酸酶抑制劑FK506通過可抑制NF-κB信號活化,下調角質形成細胞TNF-α的分泌［16,17］。本研究我們也發現1 M FK-506處理可以明顯抑制P物質誘導的HaCaT細胞NF-κB/p65核轉位(圖3),同時還顯著下調HaCaT細胞抗菌肽CAMP mRNA和蛋白質表達水平(圖4)。盡管最近有人提出外用鈣調磷酸酶抑制劑他克莫司治療酒渣鼻具有雙刃劍的作用,除了可減輕玫瑰痤瘡的炎癥外,長期外用他克莫司有誘發或加重玫瑰痤瘡的風險［8,18］。但根據本研究結果,他克莫司仍可用于緩解玫瑰痤瘡患者的臨床癥狀,一些臨床研究也支持這一觀點［19］。

總之,本研究提供的數據提示表皮內游離的無髓鞘感覺神經纖維可能通過釋放P物質刺激角質形成細胞NF-κB信號活化,誘導抗菌肽CAMP及其活性蛋白水解物LL37過度產生,啟動和參與了玫瑰痤瘡慢性炎癥過程。針對抑制“P物質-NF-κB信號活化-抗菌肽”機制可能是治療玫瑰痤瘡的潛在新靶點。