敗醬草治療慢性盆腔炎的機(jī)制研究*

朱思源， 游卉

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410000

慢性盆腔炎，又稱盆腔炎性疾病后遺癥，是由于盆腔炎性疾病未得到及時(shí)的、正確的診斷或治療而引起，最常見的結(jié)果是引起女性反復(fù)小腹、腰骶部墜脹疼痛等不適，嚴(yán)重的不良結(jié)果則是不孕、異位妊娠等。若患者因長期反復(fù)發(fā)作的慢性盆腔炎就診于西醫(yī)院，常會(huì)被告知使用抗生素治療。長此以往，細(xì)菌耐藥性的可能性會(huì)明顯增加[1]，同時(shí)，患者也可能會(huì)出現(xiàn)過敏、腹瀉、出血等不良反應(yīng)[2]。

中醫(yī)認(rèn)為血瘀是治療慢性盆腔炎的核心，活血化瘀是基本方法[3]。敗醬草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、苦，性微寒，其清熱解毒、祛瘀止痛之功在臨床應(yīng)用中有良好的治療效果。敗醬草的抗炎、抗病毒、抑菌作用已被現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證，用敗醬草復(fù)方治療慢性盆腔炎已獲得良好的治療效果，有效率均為 85%以上[4]。江佳琳等[5]通過數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)295首治療慢性盆腔炎的方劑中，敗醬草出現(xiàn)次數(shù)位居前位，達(dá)216次之多。敗醬草或許可成為治療慢性盆腔炎的特色藥、專用藥，因此，有必要對敗醬草治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

資料和方法

1 敗醬草活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的獲得

使用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/），以“敗醬草”為檢索詞檢索敗醬草在該數(shù)據(jù)庫中記錄的活性成分，同時(shí)以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進(jìn)行活性成分的篩選。保存各活性成分在該數(shù)據(jù)庫上的靶點(diǎn)，并通過Uniprot網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）獲取基因名，對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。在Swiss Target數(shù)據(jù)庫中再次檢索敗醬草活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充并去重。

2 疾病的靶點(diǎn)

在 DrugBank 數(shù) 據(jù) 庫（https：//go.drugbank.com/）和 OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https：//omim.org/）中 以“Chronic pelvic inflammatory disease”為關(guān)鍵詞，物種為“Homo Sapiens”，檢索CPID的疾病靶點(diǎn)。

3 成分與疾病的交集靶點(diǎn)

將敗醬草活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別輸入到Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，繪制韋恩圖，得到兩者交集靶點(diǎn)。

4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將交集靶點(diǎn)與藥物活性成分對應(yīng)形成表格，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，建立藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，借助插件CytoHubba篩選敗醬草治療CPID的核心活性成分，并根據(jù)Degree值的大小對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。

5 建蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

在 STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）中輸入交集靶點(diǎn)，物種為“Homo Sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，所有參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。下載結(jié)果文件的TSV格式，Cytoscape3.9.1軟件讀取結(jié)果文件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，顏色越深、面積越大表明度值約大，應(yīng)用插件CytoHubba、根據(jù)Degree進(jìn)行Top 5 核心靶點(diǎn)篩選。

6 KEGG通路富集分析

在 DAVID（https：//david-d.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，物種設(shè)置為“Homo Sapiens，對共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析。整理相關(guān)數(shù)據(jù)，通過微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）可視化處理，繪制氣泡圖。

結(jié) 果

1 查找藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)

通過檢索及篩選，得到敗醬草的有效成分12個(gè)見表1，將兩數(shù)據(jù)庫中檢索得到的靶點(diǎn)合并去重，得到靶點(diǎn)423個(gè)。通過DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲得疾病靶點(diǎn)1324個(gè)。繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)59個(gè)見圖1。

圖1 疾病藥物交集靶點(diǎn)

表1 敗醬草有效成分

2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將59個(gè)敗醬草干預(yù)慢性盆腔炎的潛在靶點(diǎn)與所屬活性成分對應(yīng)，通過Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖2）。圖中共73個(gè)節(jié)點(diǎn)，225條邊。根據(jù)Degree值設(shè)置成分大小，Degree值排名前三的化合物有木犀草素、槲皮素、山奈酚。可能上3種成分在治療CPID中起重要作用。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

刪除兩個(gè)游離基因，將STRING數(shù)據(jù)庫中獲得的TSV文件結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中，得到含57個(gè)節(jié)點(diǎn)和662條邊的網(wǎng)絡(luò)圖。篩選得到包含 5個(gè)節(jié)點(diǎn)的核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，核心靶點(diǎn)基因分別是IL6、PTGS2、IL10、IL6、TNF。 敗醬草與 CPID 交集靶點(diǎn)基因的 PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3，優(yōu)化后的交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，PPI 核心靶點(diǎn)基因見圖5。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 優(yōu)化后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心靶點(diǎn)

4 KEGG通路富集分析

將篩選到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，相關(guān)值設(shè)為默認(rèn)，得到通路116條，選擇與疾病相關(guān)的前10條通路，分別為腫瘤通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Relaxin（松弛肽）、NF-kappa B通路、C型凝集素受體通路、MAPK信號通路等。對KEGG結(jié)果進(jìn)行可視化（圖6）。顏色越紅說明該條信號通路差異性越大，點(diǎn)面積越大說明在該通路上可富集到靶點(diǎn)越多。

圖6 KEGG氣泡圖

討 論

通過分析，敗醬草中有良好治療作用的是木犀草素、槲皮素、山奈酚等。現(xiàn)代研究表明，三者均可減少諸多炎性因子，如促炎因子腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）和環(huán)氧化酶 -2（COX-2）等的表達(dá)，減輕炎癥滲出、趨化和炎性因子刺激引起的疼痛[6-8]。炎癥的過程需要炎性細(xì)胞中IKKβ、IκBα的磷酸化，木犀草素可發(fā)揮磷酸化的抑制作用。其黃酮苷類化合物對細(xì)胞核P65的表達(dá)有一定的抑制作用，從而能有效地阻斷NF-κB信號通路進(jìn)展、實(shí)現(xiàn)抗炎的生物作用[9]。在特定細(xì)胞中，炎癥相關(guān)因子和一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)可由上游AMPK/Sirt1信號通路調(diào)節(jié)，經(jīng)研究，槲皮素對該信號通路有一定的干預(yù)作用，可阻斷信號通路的傳導(dǎo)、減少IL-12和iNOS產(chǎn)生而進(jìn)行抗炎作用；對于血管類炎癥，該化合物可降低IKK、IL-1R、CCL8和STAT3的表達(dá)來降低炎癥刺激[10]。山奈酚可通過IKKβ的激活，阻斷IκBα的磷酸化，NF-κB因無法進(jìn)入細(xì)胞核，不能激活下游炎性因子的表達(dá)，因此可降低炎性因子的釋放[11]。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示 TNF、IL6、IL10、NF-κB、PTGS2等度值排名靠前，考慮是治療CPID的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL10（白細(xì)胞介素10）可抑制細(xì)胞致炎因子的表達(dá)，如活性氧（ROS）。活性氧（ROS）是氧化損傷的重要因素[12]。且IL10可抑制TGF-β1及TNF-α，從而減少組織纖維化[13]；TNF、IL6、NF-κB是CPID中發(fā)揮重要作用的促炎因子，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移、激活或加重炎癥反應(yīng)，引起盆腔內(nèi)結(jié)締組織的充血水腫[14]；PTGS2是COX-2的編碼基因，外周組織損傷后，炎癥會(huì)誘導(dǎo)COX-2的生成釋放，合成前列腺素，從而刺激外周傷害感受器，引起疼痛。敗醬草通過抑制促炎因子及COX-2的合成，可減輕盆腔炎患者的小腹、腰骶部墜脹疼痛。反復(fù)發(fā)生的慢性盆腔炎易刺激盆腔內(nèi)生殖器官的纖維化[15]，纖維化最終會(huì)導(dǎo)致器官組織的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生損害[16]，對女性生殖功能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良后果。敗醬草可減少組織纖維化，對慢性盆腔炎引起的長遠(yuǎn)不良受孕結(jié)局有較好的改善。由此可見，敗醬草對慢性盆腔炎引起的短期、長期不良結(jié)局皆有一定的治療作用。

KEGG主要富集在Relaxin（松弛肽）、IL-17信號通路、NF-κB、TNF信號通路上。IL-17通路是與炎性疾病有關(guān)聯(lián)的通路，新研究表明該通路上的因子可維持粘膜免疫和障壁完整度，這兩種生物功能有利于提升宿主防御能力，對抗細(xì)菌、病毒等侵襲[17]。松弛肽是一種肽類激素，可通過結(jié)合松弛素樣肽受體（relaxin family peptide receptor 1 ，RXFP1 ）發(fā)揮諸多生物學(xué)功能，如激活MAPKs、PI3K、PKC等信號通路；另外，該通路還能發(fā)揮抗纖維化的生物功能[18]。TNF與 TNFR1受體結(jié)合后可激活TNF 信號通路，激活的TNF 信號通路可以加強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子、生長因子和TNF-α 本身等基因的表達(dá)[19]。NF-κB是參與巨噬細(xì)胞發(fā)揮炎癥作用的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其活化需要IκB 的調(diào)節(jié)控制。在靜息狀態(tài)下，IκB 與 NF-κB 雜二聚體相互結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中，抑制 NF-κB 活化，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)，IκB 與 NF-κB分離，NF-κB與磷酸基團(tuán)結(jié)合活化并進(jìn)入細(xì)胞核，激活并釋放下游炎性因子，炎癥反應(yīng)被逐漸放大[20]。TNF-α 信號通路是調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要通路之一，可干預(yù)多種與炎性損傷、氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的疾病結(jié)局，該通路可通過激活巨噬細(xì)胞，大量的炎性細(xì)胞因子被子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)新生血管生成和內(nèi)皮通透性，細(xì)胞黏附作用加強(qiáng)，引起盆腔炎癥、或加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致盆腔周圍臟器粘連[21]。

臨床應(yīng)用

不少臨床已報(bào)道敗醬草復(fù)方用于治療慢性盆腔炎，內(nèi)服和綜合治療均獲得顯著療效[4]。何若蘋老先生應(yīng)用敗醬草治療慢性盆腔炎瘀血較重、脈弦澀患者[22]；夏桂成及蔡小蓀兩位老先生則更加注重?cái)♂u草清熱利濕之功效，將其運(yùn)用在慢性盆腔炎之濕熱偏重時(shí)[23]。王登等對含敗醬草中成藥的處方進(jìn)行收集整理，發(fā)現(xiàn)該類中成藥主要用以帶下之濕熱下注、腹痛之瘀血內(nèi)阻證。在臨證處方時(shí)，可配伍赤芍、蒲公英等加強(qiáng)敗醬草的活血化瘀、清熱利濕之功[24]。

本研究預(yù)測了敗醬草治療慢性盆腔炎的主要作用機(jī)制，說明敗醬草可能通過“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”發(fā)揮抗慢性盆腔炎作用，為進(jìn)一步治療慢性盆腔炎提供了新的用藥思路。