宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變與EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性分析#

陳婷婷 王曉梅 修小斐 孫紅靜 高峰

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050051）

宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（Squamous intraepithelial lesion，SIL）是宮頸鱗狀細(xì)胞癌的癌前病變，包括低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）[1]。SIL 的病理診斷對阻止SIL 向浸潤性宮頸癌轉(zhuǎn)變尤為重要。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ezrinradixin-moesin 結(jié)合磷酸化蛋白50（Ezrin-radixinmoesin binding phosphoprotein 50，EBP50）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。在膽管癌，大腸癌，食道癌等中EBP50 表達(dá)明顯減少，且與腫瘤分化程度、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-5]。但EBP50 在SIL 中的表達(dá)情況未見報(bào)道。盡管宮頸病變中p16/Ki-67 聯(lián)合檢測有助于提高HSIL 的檢測率[6]，但EBP50 與p16、Ki-67 的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化比較 EBP50 在正常宮頸組織和SIL 中的表達(dá)情況，并分析EBP50、p16 和Ki-67 在SIL 中表達(dá)的相關(guān)性，探討EBP50 在宮頸病變發(fā)生、發(fā)展中的作用及病理診斷意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2018 年10 月至2020 年06 月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院宮頸活檢及手術(shù)切除SIL 標(biāo)本80例，分為兩組：LSIL 為24 例，HSIL 為56 例。SIL 患者的中位年齡為44 歲（25 歲至79 歲）。對照組為21 例宮頸病變周圍區(qū)域的正常宮頸組織。所選病理標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行組織脫水，石蠟包埋。

1.2 試劑

兔抗人EBP50 單克隆抗體購自Abcam 公司。小鼠抗人p16、Ki-67 單克隆抗體及免疫顯色試劑（Max Vision-HRP）購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化檢測EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)

將石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波熱處理修復(fù)抗原，然后分別加入EBP50（1:200）、p16（1:100）和Ki-67（1:100）抗體，4°C 孵育過夜后加入免疫顯色試劑（Max Vision-HRP）在37°C 孵育30 min。滴加DAB 顯色液，用蘇木精復(fù)染后，將切片脫水并封固。PBS 代替一抗，做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

EBP50 蛋白表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)臨床病理特征的相似性，將EBP50 陰性和弱染色判定為低表達(dá)，中和強(qiáng)染色判定為高表達(dá)。p16 陽性染色為鱗狀上皮下1/2 或超過下1/2 出現(xiàn)連續(xù)彌漫性的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色，p16 完全不染色或局灶斑點(diǎn)狀上皮染色時(shí)為陰性表達(dá)。Ki-67 的核染色主要出現(xiàn)副基底層且陽性細(xì)胞數(shù)＜30%為陰性表達(dá)，超過副基底層以上出現(xiàn)細(xì)胞核染色且陽性細(xì)胞數(shù)≥30%判定為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用卡方檢驗(yàn)分析正常宮頸組織與SIL 中EBP50 表達(dá)的差異，以及不同級別SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)的差異。Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)分析EBP50 與p16、Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性。P 值＜0.05 具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸組織和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67表達(dá)

免疫組化檢測正常宮頸組織和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)，見圖1、圖2、表1。正常宮頸組織中EBP50 高表達(dá)染色為19 例（90.5%），而低表達(dá)2 例（9.5%）；30 例（37.5%）SIL 中EBP50 高表達(dá)染色，50 例（62.5%）為低表達(dá)；正常宮頸組織中EBP50 表達(dá)水平明顯高于SIL（χ2=16.429，P=0.000）。p16 在全部正常宮頸組織中表達(dá)陰性，而80 例SIL 中p16 陽性表達(dá)為66例，占82.5%。SIL 中Ki-67 陰性表達(dá)為30 例（37.5%），Ki-67 陽性表達(dá)為50 例（62.5%）；21例正常宮頸組織Ki-67 表達(dá)均為陰性；SIL 中p16和Ki-67 表達(dá)明顯高于正常宮頸組織（χ2=49.995，P=0.000；χ2=25.993，P=0.000）。

表1 正常宮頸組織和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)

圖1 正常宮頸組織中免疫組化（×200）

圖2 免疫組化代表圖（×200）

2.2 EBP50、p16 和Ki-67 在SIL 中的表達(dá)

在LSIL 中，EBP50 低表達(dá)6 例（25.0%），高表達(dá)18 例（75.0%）；而HSIL 中EBP50 高表達(dá)12 例（21.4%），低表達(dá)44 例（78.6%）；EBP50 高表達(dá)率從LSIL 到HSIL 顯著下降（χ2=20.571，P=0.000），見圖2、表2。14 例（58.3%）LSIL 中p16 呈陽性表達(dá)，10 例（41.7%）LSIL 中p16 染色陰性；在HSIL 中，p16 陽性表達(dá)為52 例（92.9%），而p16 陰性表達(dá)為4 例（7.1%）；p16 在HSIL 中的表達(dá)陽性率明顯高于 LSIL（χ2=13.696，P=0.000），見圖2、表2。Ki-67 陰性表達(dá)分別為LSIL 的22 例（91.7%）和HSIL 的8 例（14.3%）；Ki-67 陽性表達(dá)的病例中LSIL 為2 例（8.3%），HSIL 為48 例（85.7%）；HSIL 的Ki-67 陽性率明顯高于LSIL（χ2=42.921，P=0.000），圖2、表2。

表2 SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表達(dá)

2.3 SIL 中EBP50 與p16、Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，SIL 中EBP50 與p16、Ki-67 表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性，EBP50 與p16、Ki-67 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.459，P=0.000，r=-0.360，P=0.010），見表3。

表3 SIL 中EBP50 與p16、Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

宮頸癌近年來發(fā)病率有明顯上升趨勢。LSIL可自行消退，而HSIL 更易發(fā)展為浸潤性癌[7]。SIL分級的病理診斷對患者的臨床治療極為重要。因此，在宮頸病變中尋找一些生物標(biāo)志物對SIL 的診斷非常重要。EBP50 由兩個(gè)串聯(lián)的PDZ 結(jié)構(gòu)域組成，參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用[2]。本研究結(jié)果表明，21 例正常宮頸組織中EBP50 的高表達(dá)率為90.5%，而80 例SIL 中EBP50 的高表達(dá)率降至37.5%。此外，EBP50 在LSIL 中的高表達(dá)明顯高于HSIL，提示EBP50 可能在SIL 中失去對宮頸鱗狀上皮的保護(hù)作用。p16 是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，具有抑制細(xì)胞生長和腫瘤的生物學(xué)特性[8]。據(jù)報(bào)道，在正常的宮頸鱗狀上皮中，p16完全缺失或偶有局灶陽性[9]。HPV E7 蛋白抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Retinoblastoma，Rb）蛋白，導(dǎo)致p16 蛋白積聚和子宮頸細(xì)胞增殖，因此p16 可以提高宮頸疾病診斷的準(zhǔn)確性[10]。HPV E6/E7mRNA高表達(dá)是子宮頸癌變得重要標(biāo)志[11]。HPV16 病毒產(chǎn)生的癌蛋白E6 以PDZ 依賴的方式結(jié)合EBP50 促進(jìn)EBP50 的降解。E7 通過CDK1/2誘導(dǎo)EBP50磷酸化，促進(jìn)E6 結(jié)合和降解EBP50[12]。在HPV16 陽性子宮頸癌來源的細(xì)胞系（例如SiHa和CaSki）也觀察到EBP50 蛋白水平的下調(diào)[13]。在本研究的80 例SIL 患者中，p16 的陽性率從LSIL 的58.3%上升到HSIL 的92.9%，提示p16有助于識別SIL 的分級。大部分LSIL 病例EBP50高表達(dá)，p16 陰性表達(dá)。而在HSIL 中大部分p16陽性，EBP50 低表達(dá)。通過SIL 中EBP50 和p16之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EBP50 表達(dá)與p16 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Ki-67 是細(xì)胞增殖的指標(biāo)，是一種在增殖細(xì)胞中表達(dá)的核抗原。除靜止期（Go）外，該抗原在細(xì)胞周期的所有階段均有表達(dá)[14]。Ki-67 標(biāo)記指數(shù)與SIL 的程度成正比[15]，Ki-67 染色可以預(yù)測SIL 進(jìn)展，在這方面優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的組織病理學(xué)分級[16]。研究中可得出，Ki-67 在LSIL 中的陽性率為8.3%，而在HSIL 中的陽性率為85.7%。顯然，Ki-67 在LSIL 中的陽性率遠(yuǎn)低于HSIL。p16 和Ki-67 的免疫組化結(jié)果是LSIL 和HSIL 病理診斷的重要參考指標(biāo)。與p16 一樣，EBP50 與Ki-67表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，正常宮頸組織中EBP50表達(dá)多數(shù)以高表達(dá)為主，而SIL 中以低表達(dá)為主。p16 和Ki-67 蛋白的表達(dá)均隨SIL 的級別增加而增加，而EBP50 在SIL 的級別中呈負(fù)相關(guān)。鑒于此，我們推測EBP50 有可能作為診斷早期宮頸癌前病變的免疫標(biāo)志物。