人羊膜上皮細胞對大鼠軟骨損傷的修復作用

王康，智曉東，張玉強，張文景，王偉

骨性關節炎（OA）是老年人致殘的主要原因之一，而且隨著人口老齡化進程其發生率逐年升高[1-2]。近年來，人羊膜上皮細胞（hAECs）引起了廣泛關注，與其他類型的干細胞相比，hAECs 具有擴增能力更強、避免倫理爭論、低免疫原性和非致瘤性等優勢[3-4]。目前已發現hAECs 在治療肝臟疾病、神經損傷、皮膚瘢痕等領域取得了良好的效果，有望成為再生醫學中一種可靠的細胞來源[5]。JAK2/STAT3 信號通路可通過參與炎癥反應來調控細胞的代謝和更新，目前已證實該通路的激活對心肌細胞、肺上皮細胞、腸黏膜細胞均有保護作用[6-7]。本文通過將hAECs 移植至大鼠關節腔，其對OA軟骨的修復作用，并觀察JAK2/STAT3信號通路在修復過程中的激活情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 剖宮產后的羊膜樣本收集自2021年錦州醫科大學附屬第一醫院婦產科，獲得錦州醫科大學附屬第一醫院醫學研究倫理委員會批準，產婦術前均簽署知情同意書。成年健康雄性200 ～300 g 的SD 大鼠30 只，購自錦州醫科大學動物中心，動物實驗獲得錦州醫科大學實驗動物倫理審查。

1.2 OA 模型的構建 采用改良Hulth 法建立大鼠OA 模型[8]，飼養8 周后進行后續實驗。

1.3 實驗分組 將已造模成功的雄性SD大鼠隨機分為實驗組和陰性對照組，另設空白對照組（健康大鼠），各10 只。0.5%異氟烷輕度麻醉大鼠后，行膝關節腔內注射。實驗組：注射100lDMEM-F12（含1×106個hAECs 細胞）；陰性對照組：注射100l的DMEMF12；空白對照組不做任何處理。飼養1 個月之后進行后續實驗。

1.4 hAECs的原代分離、純化、培養以及傳代 PBS洗滌羊膜組織，置于滅菌培養皿中。剪成3cm2左右，移至10cm 培養皿中。加入20ml 0.25%胰酶，37 ℃，1 200 r/min，消化10 min，將獲得的消化液棄去；加入20 ml 0.25%胰酶，1 200 r/min 消化40 min，加入培養基終止消化，收集消化液，用300 目細胞篩網濾過，重復3 次。收集每次獲得的過濾液，4 ℃，1 200 r/min離心10 min，棄上清，重懸沉淀，接種到培養皿中。培養箱靜置培養，48 h 后首次換液，用0.25%胰酶消化傳代培養，光鏡下觀察拍照。

1.5 免疫細胞化學鑒定hAECs 取第3 代hAECs，0.25%胰酶消化，接種于培養皿中，孵箱培養。24 h后PBS 洗滌，固定；通透，PBS 洗滌。封閉后，滴加一抗CK19 或Vimentin，4 ℃過夜，PBS 洗滌。滴加二抗，孵育1 h，PBS 洗滌。避光孵育5 min，PBS 洗滌；封片，鏡下觀察。

1.6 流式細胞儀鑒定hAECs 取第3 代hAECs，0.25%胰酶消化，分裝到1.5 ml EP 管中。1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入0.3%BSA 溶液，每管200l，室溫密封30 min，1 200 r/min 離心5 min。棄上清，加入小鼠抗人單克隆抗體分化簇CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4 ℃靜置20 min。PBS洗滌2 次，上流式細胞儀檢測細胞表型。

1.7 膝關節軟骨大體及組織化學染色觀察 取大鼠膝關節行大體觀察。制作切片染色10min，PBS 洗滌，分化15 s，見切片變紅，水洗2 min，甩干。返藍10 s，水洗2min，甩干。滴加伊紅染色液，染色45s。依次經過梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.8 免疫組化染色檢測COL2、MMP和TIMP表達將石蠟切片加熱2h。脫蠟，自來水洗5min，將脫蠟后的切片置于檸檬酸鈉抗原修復液中，水浴50min。取出切片，PBS 清洗，加入COL2、MMP和TIMP 一抗，每張切片50l，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，PBS 洗滌。滴加二抗，室溫孵育1 h。以DAB 顯色液顯色，脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。

1.9 Masson 染色 取大鼠膝關節，制石蠟切片，脫蠟，鉻化。染核5 ～10 min。充分水洗，用麗春紅酸性復紅液5 ～10 min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3 ～5min。苯胺藍染5min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，脫水、二甲苯透明、封片，鏡下觀察拍照并記錄。

1.10 番紅固綠染色 取大鼠膝關節，制石蠟切片。脫蠟，自來水洗，固綠染色，自來水沖洗，至軟骨呈無色，分化液浸泡，自來水稍洗。番紅染色：切片入番紅染液15 ～30 s，脫水，透明封片，觀察拍照。

1.11 ELISA檢測炎癥因子含量 取凍存滑膜樣本加入PBS，充分研磨，4℃條件下，2000r/min，離心20min，收集上清液，同時取凍存血清樣本。細胞因子TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 分別按廠家說明書用ELISA 試劑盒檢測。

1.12 Western-bolt 檢測EGFR信號通路相關蛋白取大鼠膝關節軟骨組織，用Trizol 法提取蛋白質，經定量后取60g 蛋白質，凝膠電泳，轉膜，滴加p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 一抗，4 ℃孵育過夜。滴加二抗，室溫孵育2 h。加入A、B 液（ECL 系統）后化學發光，使用Quantity One 分析軟件進行蛋白條帶的定量分析。

1.13 統計方法 使用Image J 和SPSS 20.0 進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，3 組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 檢驗或NewmaneKeuls 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hAECs 的特征鑒定 接種后2 d 內，細胞黏附在壁上，原代細胞（P0）呈現散在細胞團生長，第1 代和第2 代的hAECs增殖速度最快，第3 代hAECs形態最為典型，顯示出鋪路石樣的上皮細胞形態，第4代胞質逐漸鋪開，出現老化現象，見圖1a；免疫熒光染色顯示CK19 強表達，Vimentin 弱表達，見圖1b；流式細胞術檢測hAECs 表面標志物的表達，結果顯示CD29、CD44、CD73、CD90 和CD105 呈陽性，CD34 和CD45 呈陰性，見圖1c。

圖1 hAECs 形態觀察（×400），免疫熒光（×400）及流式細胞儀鑒定

2.2 關節軟骨病理切片分析 觀察各組軟骨組織的大體形態，空白對照組膝關節軟骨面光滑，無充血、裂紋等；陰性對照組關節腔內有明顯關節積液，軟骨表面磨損部分脫落缺損；實驗組軟骨表面較為光滑，可觀察到明顯的軟骨再生。HE 染色顯示空白對照組關節滑膜細胞形態良好，未見明顯炎性細胞浸潤；陰性對照組纖維軟組織伴局部膠原化變，伴部分炎性細胞浸潤；實驗組關節腔面局部稍粗糙，纖維間質形態較規則，炎性細胞浸潤不明顯，見圖2。

圖2 大鼠膝關節大體觀察和鏡下觀察（HE，×50）

2.3 Masson 染色和番紅固綠染色觀察 Masson 染色中，空白對照組染色正常，軟骨膠原密集且排列整齊，表層光整，形態和分布均勻；陰性對照組的軟骨藍綠色染色丟失嚴重，表層不光整；實驗組軟骨排列略顯不規則，但相較于陰性對照組軟骨染色幾乎保持完整著染，表層光整。番紅固綠染色中，空白對照組顯示軟骨排列整齊，層次清晰，潮線完整；陰性對照組軟骨細胞排列紊亂，中度失染，潮線模糊；實驗組軟骨細胞增生明顯，排列稍亂但層次可分，見圖3。

圖3 大鼠膝關節軟骨Masson 和番紅固綠染色（×20）

2.4 COL2、MMP 和TIMP 免疫組化分析 COL2、MMP 和TIMP 蛋白表達均表達于細胞質（呈棕黃色顆粒）。陰性對照組的COL2 和TIMP 表達強度明顯弱于空白對照組，MMP 表達強于空白對照組；實驗組COL2 和TIMP表達強度明顯強于陰性對照組，MMP 表達弱于陰性對照組，見圖4。

圖4 大鼠膝關節軟骨COL2、MMP 和TIMP表達（免疫組織化學染色，×20）

2.5 各組大鼠血清及滑膜中炎癥因子含量比較 3組大鼠血清及滑膜中炎癥因子含量差異均有統計學差異（F≥30.561，均P ＜0.05）。陰性對照組大鼠的血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 含量均明顯高于空白對照組（均P ＜0.05），實驗組大鼠血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 含量均明顯低于陰性對照組（均P＜0.05），見表1 ～2。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子含量比較

表2 各組大鼠滑膜中炎癥因子含量比較

2.6 Western-bolt 檢測JAK2/SATA3 信號通路相關蛋白表達情況 3 組大鼠膝關節軟骨JAK2/SATA3 信號通路相關蛋白表達量差異均有統計學差異（F=34.176、9.273，均P ＜0.05）。陰性對照組內蛋白表達檢測與空白對照組相比，p-JAK2 與p-STAT3 蛋白表達量均減少（均P ＜0.05）。實驗組p-JAK2 與p-STAT3 蛋白表達量均高于陰性對照組（均＜0.05），見封三彩圖1。

圖1 各組大鼠膝關節軟骨JAK2/SATA3 信號通路相關的蛋白表達

3 討論

近年來，干細胞治療OA 的良好效果受到了普遍的關注，在安全性、疼痛緩解和軟骨再生方面顯示出巨大潛力。本研究將提取到的hAECs 進行形態學觀察、免疫熒光和流式細胞術鑒定，結果表明hAECs呈現典型的鋪路石樣形態，高表達CK19 而不表達波形蛋白。流式細胞儀檢測結果表明提取的hAECs 表達干細胞表面標記物，與之前的研究結果一致[9-10]。

目前認為，COL2 是維持正常軟骨結構、功能的重要組成部分之一[11]，而MMP和TIMPs的變化能反映出軟骨基質中Ⅱ型膠原的代謝變化[12]。本研究發現移植hAECs 能明顯減輕軟骨磨損，減少炎性細胞浸潤；未接受hAECs 移植的OA 大鼠COL2 和TIMP表達和正常大鼠相比明顯減弱，MMP 表達增強，而在移植了hAECs之后，COL2 和TIMP表達明顯增多，而MMP 表達減弱。這表明hAECs 能有效調節大鼠軟骨中COL、MMP 和TIMP 的含量，保護軟骨細胞，修復受損組織，起到延緩關節軟骨退變的作用。另外，本研究結果顯示陰性對照組OA大鼠血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 水平均高于空白對照組，移植hAECs 后可明顯抑制上述炎癥因子表達。這提示hAECs 可通過抑制OA 大鼠血液系統及局部滑膜部位炎性反應而改善大鼠膝關節結構及功能。

JAK2/STAT3 信號通路是調控OA 病程進展中重要的通路之一。本研究對比了各組JAK2/STAT3信號通路的相關蛋白的表達情況，結果顯示p-JAK2和p-STAT3 在陰性對照組中表達相較于健康大鼠減弱，而在移植了hAECs 進行治療后表達增強。因此，本研究認為hAECs 對于OA 的炎癥因子、膠原蛋白以及相關蛋白酶的表達是通過JAK2/P-STAT3 信號通路來調控的。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 王康：實驗設計、實驗操作、統計分析、論文撰寫；智曉東：實驗指導、數據整理；張玉強、張文景：細胞培養、實驗檢測；王偉：研究指導、論文修改、經費支持