慢性粒-單核細胞白血病與骨髓增生異常綜合征的遺傳學差異分析

吳越，陳瑩，石淙，鄒多兵，王怡，牧啟田

慢性粒單核細胞白血病（CMML）是一種臨床少見的造血系統克隆性疾病，發病率為（3 ～4）/10 萬，主要表現為骨髓中的一系或多系病態改變，外周血單細胞持續增多（＞1×109/L）。既往，CMML 被認為是骨髓增生異常綜合征（MDS）的一個亞型，但鑒于其兼有骨髓發育異常和骨髓增殖的特點，2001 年WHO造血和淋巴細胞腫瘤分類將CMML歸屬于骨髓增生異常/骨髓增殖性疾病（MDS/MPN）[1-2]。Geyer等[3]提出寡單核細胞CMML 特殊亞型，從而更好地區分早期“增生不良”的CMML 和骨MDS。近年來隨著二代測序技術等高通量技術的發展，發現CMML和MDS 患者存在高頻突變。這些突變涵蓋了多種基因控制通路，其中包括表觀遺傳改變、剪接體復合通路依據轉錄因子和信號調節異常。但是關于CMML與MDS遺傳學異常，尤其是基因突變差異分析的研究國內罕見報道。本文回顧性分析32 例CMML 患者和159 例MDS 患者的臨床資料，比較CMML 與MDS 染色體核型和基因突變特征，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年1 月至2021 年9 月在寧波市第一醫院就診且完成染色體核型或基因突變檢查的CMML 或MDS 患者（CMML 32 例，MDS 159 例）的臨床和實驗室資料，并參照WHO（2016）標準進行診斷分型。本研究通過寧波市第一醫院醫學倫理委員會審查批準（2022RS021）。

1.2 染色體核型檢查 抽取骨髓，接種于含20%小牛血清1 640 培養基中，37 ℃培養16 ～24 h，加入秋水仙酰胺，使細胞阻滯在分裂中期，經低滲、預固定、3 次固定等步驟制備染色體懸液。將細胞懸液在玻片上過火滴片，R 顯帶后，用吉姆薩液染色。顯微鏡分析10 ～20 個分裂中期細胞及染色體核型。依據《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）2020》進行核型描述。

1.3 二代測序檢測基因突變 提取CMML、MDS患者骨髓細胞，抽提基因組DNA，采用Ampliseq 多重PCR 擴增并構建樣本文庫，在Ion proton 平臺上進行高通量測序，測序后參考COSMIC 數據庫進行生物信息學分析，確定致病性基因突變位點，測序深度為2 000×。檢測由武漢康圣達醫學檢驗所完成。檢測位點包括NRAS、DNMT3A、SF3B1、IDH1、TET2、EZH2、JAK2、CBL、ETV6、IDH2、TP53、SRSF2、ASXL1、RUNX1 共14 種常見MDS 相關基因突變位點。

1.4 統計方法 數據使用SPSS 21.0 統計軟件進行分析。計量資料比較采用Mann-Whitney U 檢驗，計數資料比較采用2檢驗或Fisher 確切概率法。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CMML 與MDS 一般臨床實驗室指標比較CMML 患者中寡單核 CMML 7 例（21.88%），CMML-0 6 例（20.69%），CMML-1 13 例（44.83%），CMML-2 6 例（18.75%）；按照M.D.安德森預后積分（MDAPS）進行預后分層，其中低危6 例（18.75%），中危（中危1+2）24 例（75%），高危2 例（6.25%）。MDS 患者按照IPSS-r 劃分：低危（極低危+低位）36例（26.64%），中危49 例（30.82%），高危（極高危+高危）56 例（35.22%），因統計資料不完整無法分層18例（11.32%）。

與MDS 患者相比，CMML 患者的男性、血小板計數、白細胞計數、中性粒細胞計數、單核細胞計數、骨髓原始細胞比例、乳酸脫氫酶和2 微球蛋白更高（均P＜0.05）；兩組年齡、血紅蛋白及血清鐵蛋白水平等差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 CMML 與MDS 臨床實驗室指標特征比較

2.2 CMML 與MDS 染色體核型差異分析 在32例CMML 患者中，有30 例進行染色體核型檢測，8例（8/30，26.67%）為異常核型，見表2；MDS 患者有155 例行染色體核型檢測，其中80 例為異常核型（80/155，51.61%），CMML患者發現異常核型率低于MDS 患者（2=7.450，＜0.05），其中+8、+Mar 和－7/del(7q)是MDS 的常見異常核型，見圖1。

圖1 CMML 和MDS 異常核型的構成

表2 8 例CMML 染色體異常核型

2.3 CMML 與MDS 基因突變分析 CMML 患者中有21 例行基因突變檢測，其中18 例至少有一種基因突變（18/21，85.71%）：MDS 患者有75 例行基因突變檢測，有45 例至少有一種基因突變（45/75，60.0%），CMML 發生基因突變率遠高于MDS（2=4.809＜0.05）。

CMML 伴有基因突變患者中，僅1 種基因突變6例（6/18，33.33%），同時有2種基因突變7例（7/18，38.88%），3 種基因突變2 例（2/18，11.1%），4 種基因突變3 例（3/18，16.67%）。常見的基因突變依次為ASXL1（6/18，33.33%）、TET2（6/18，33.33%）、NRAS（5/18，27.78%）、SF3B1（4/18，22.22%）、RUNX1（3/18，16.67%）。MDS 中僅1 種基因突變23 例（23/45，51.11%），有2 種基因突變11 例（11/45，24.44%），同時有3 種基因突變5 例（5/45，11.11%），有4 種基因突變1 例（1/45，2.22%），同時超過4 種基因突變的有5 例（5/45，11.11%）。常見的基因突變依次為AXSL1（18/45，40.00%）、TP53（17/45，33.78%）、RUNX1（15/45，33.33%）、EZH2（13/45，28.89%）、SF3B1（13/45，28.89%），見圖2。

圖2 CMML 和MDS14 種基因突變的分布

進一步將14 種基因突按照功能分類：表觀遺傳學調控因子（包括AXSL1、EZH2、TET2、DNMT3A、IDH1/2）、信號轉導因子（CBL、JAK2 和NRAS）、pre-RNA 剪接因子（SF3B1 和SRSF2）、DNA 損傷因子（TP53）和基因轉錄因子（RUNX1、ETV6）。分析結果發現，CMML 表觀遺傳學調控基因突變率和信號通路調控的基因突變率均高于MDS（均＜0.05），而其他類型差異均無統計學意義，見表3。

表3 CMML 與MDS 基因功能的基因突變率比較 例（%）

3 討論

在本研究中，與MDS 患者相比，CMML 患者白細胞計數更高，粒細胞及單核細胞增多，骨髓原始細胞比例更高，且伴有更高的血小板（均P ＜0.05）。這反映了CMML骨髓增殖特性，進而導致血小板進一步增加。同時筆者觀察到CMML 患者相較MDS患者具有較高的乳酸脫氫酶和2 微球蛋白（均P ＜0.05），這也反映了CMML 由于細胞增殖呈現高代謝狀態，與Germing 等[4]研究結果較為一致。

本研究CMML患者染色體異常檢出率為26.67%，與國外文獻報道20%～30%[5]結果較為一致。CMML總體染色體異常率明顯低于MDS（P ＜0.05）。CMML 常見染色體異常類似于MDS，以+8、－Y、－7/7q－、20q－等為主[6-7]，但孤立性5q－要明顯低于MDS[8]。本研究盡管CMML病例數較少，但+8 有3 例。

國外文獻報道接近90%的CMML 患者可能出現分子學異常[9]。本研究中CMML 患者基因突變率為85.7%。在波蘭的一項研究中，檢測42 種基因突變，發現100%CMML患者存在至少1 個基因突變，而74% MDS 患者存在至少1 個基因突變[10]。在單個基因突變中，NRAS 基因突變率也明顯高于MDS（P ＜0.05）。Han 等[11]研究發現，NRAS 突變在CMML中出現的概率約為36.17%，本研究NRAS基因突變出現的頻率為23.81%，低于上述報道，這可能與本隊列中含有7 例寡單核細胞CMML 患者有關。Carr 等[12]研究證實NRAS 突變能通過KMT2APLK1 軸持續促進細胞增殖，這可能是CMML 白細胞計數高于MDS原因之一。本研究結果顯示CMML患者CBL基因突變概率高于MDS患者（P＜0.05），這與Schnittger 等[13]研究發現，CBL 突變在CMML中發生的概率約為10%，遠高于MDS 的CBL 突變（小于5%）。研究顯示，CBL 突變與白細胞計數呈正相關，是CMML去甲基化治療獨立預后的不良因素。新近一項研究發現，CBL 突變與LYN 激活能促進CBL 自身磷酸化，激活PI3K/AKT 信號，從而促進CMML 腫瘤細胞持續增值。本研究進一步把基因按照功能進行分類，發現CMML參與表觀遺傳學調控和信號通路調控的基因突變的頻率高于MDS（均P ＜0.05），這提示兩種疾病分子發病機制存在差異。

總之，與MDS 相比，CMML 具有高代謝性，更低染色體異常率，更高基因突變率。本研究還存在許多不足，如樣本量不大，檢測基因突變種類不多，還需要進一步擴大樣量、增加基因突變種類進行多中心研究來驗證。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 吳越：采集數據、分析數據、統計分析、撰寫論文；陳瑩：數據采集、分析數據；石淙、鄒多兵：采集數據；王怡：研究指導、行政、技術支持；牧啟田：研究指導、論文修改、經費支持