CHI3L1 通過(guò)上調(diào)Wnt4 表達(dá)引起大腸癌細(xì)胞輻射抵抗的機(jī)制研究

金銘，葉爽，鄭真，劉開(kāi)泰

大腸癌（CRC）包括結(jié)腸癌和直腸癌，是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤[1]。放射治療雖然是CRC 特別是直腸癌的重要治療手段，但仍有相當(dāng)一部分直腸癌患者對(duì)放射治療不敏感[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，不到1/5 的局部晚期直腸癌患者在標(biāo)準(zhǔn)新輔助放化療后可以獲得病理完全緩解[4]。殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1）最初發(fā)現(xiàn)于人骨肉瘤細(xì)胞系MG63 中[5]，在細(xì)胞增殖和抗凋亡作用中發(fā)揮著重要作用[6]，并且被進(jìn)一步鑒定為促癌因子，可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。研究表明，CHI3L1 在CRC細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)，且是影響CRC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。此外，CHI3L1還可以影響CRC 細(xì)胞對(duì)靶向藥物西妥昔單抗的敏感性[10]。近來(lái)研究表明，CHI3L1 過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的輻射抵抗密切相關(guān)，特別是在膠質(zhì)瘤和乳腺癌中[11-12]。然而CHI3L1 在CRC 輻射抵抗中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不明確，本研究擬進(jìn)一步探討CHI3L1 在CRC 細(xì)胞輻射抵抗中的作用及其潛在分子機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床數(shù)據(jù) 從TheCancerGenomeAtlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得380 例CRC 患者的CHI3L1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，包括380 例CRC 組織樣本和51 例癌旁組織樣本，其中 31 例為配對(duì)組織樣本（https://xena.ucsc.edu）。此外，保存于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的40 例配對(duì)CRC 及其癌旁組織樣本亦用于本研究，由寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化分析 將40 例配對(duì)CRC 組織樣本進(jìn)行免疫組化分析，采用組織化學(xué)評(píng)分半定量測(cè)量CRC組織樣本和癌旁組織樣本中CHI3L1蛋白的表達(dá)水平。H-SCORE=∑（PI×I）=（弱強(qiáng)度細(xì)胞百分比×1）+（中等強(qiáng)度細(xì)胞百分比×2）+（強(qiáng)強(qiáng)度細(xì)胞百分比×3）[12]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究主要使用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620 和HCT116。將細(xì)胞置于37℃含5%CO2的恒溫環(huán)境中，使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均含有10% 胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度及狀態(tài)，按1∶3 的比例每2 ～3 天傳代培養(yǎng)1 次。

1.4 CHI3L1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 在前期研究中，筆者成功構(gòu)建了CHI3L1 過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其儲(chǔ)存在寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。本研究所用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法同前[10]。

1.5 siRNA 和轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 3000 說(shuō)明書(shū)，對(duì)未經(jīng)輻照的CRC 細(xì)胞系SW620-pCDH、SW620-CHI3L1、HCT116-pCDH 和HCT116-CHI3L1進(jìn)行siNC 或siWnt4 轉(zhuǎn)染。

1.6 輻照設(shè)備及參數(shù) 輻照設(shè)備：SiementsPrimus.H直線加速器；輻照參數(shù)：6 MV X線，源皮距為100 cm，劑量率為200 Gy/min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整照射野大小及準(zhǔn)直器角度。

1.7 菌落形成試驗(yàn) 通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同劑量輻射后CRC 細(xì)胞克隆形成能力。將1.2%的瓊脂糖與2×DMEM按體積比1∶1 混合，制備0.6%的底層瓊脂糖，按每孔1.4 ml 鋪在六孔板上，讓其凝固。將細(xì)胞密度調(diào)整為10 000 個(gè)/ml。將0.6%瓊脂糖與2×DMEM按1∶1 比例混合，得到0.3%的上層瓊脂糖，并將1 ml 上層瓊脂糖與500l 細(xì)胞懸液混合，加入六孔板，每孔細(xì)胞密度為5 000 個(gè)/孔，靜置凝固。將六孔板置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)2 ～3 周。最后，對(duì)圖像進(jìn)行采集和分析。

1.8 細(xì)胞免疫熒光 采用DAPI染色評(píng)價(jià)不同劑量輻射后CRC 細(xì)胞的核破壞情況。按5 000 個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在六孔板中培養(yǎng)。棄用培養(yǎng)液后，加入1 ml 4%多聚甲醛，室溫固定20 min。室溫下，將細(xì)胞暴露于濃度為1g/ml 的DAPI 工作溶液中10 min。最后，用熒光顯微鏡采集圖像。

運(yùn)用EdU 染色評(píng)估輻射后CRC 細(xì)胞增殖情況，根據(jù)EdU-488 細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。加入濃度為10mol/L 的EdU 工作液，37 ℃孵育2 h。然后加入0.5%TritonX-100 孵育10min，再在黑暗中加入0.5ml Click反應(yīng)孵育30min。最后，通過(guò)熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.9 流式細(xì)胞檢測(cè) 將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種在六孔板上，根據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀用于區(qū)分凋亡細(xì)胞（Annexin-V 陽(yáng)性）和壞死細(xì)胞（Annexin-V 陰性和PI 陽(yáng)性）。細(xì)胞周期檢測(cè)也同樣應(yīng)用流式細(xì)胞儀。

1.10 Real-time PCR 總RNA用TRIzol試劑提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Wnt4 引物序列：Wnt4-F：5’-CGGAACCTGGAAGTCATG-3’，Wnt4-R：5’-CGAAGAGATGGCGTACAC-3’。根據(jù)SYBRGreen 說(shuō)明書(shū)，設(shè)置反應(yīng)體系為SYBRGreen 主混合液10l、上下游引物各0.4l、模板cDNA2l，然后加去離子水補(bǔ)充至20l。PCR反應(yīng)條件：95℃加熱30s，95℃變性10s，58℃退火30s，72 ℃延伸30 s；反應(yīng)持續(xù)40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品使用3個(gè)重復(fù)孔。用2－ Ct方法計(jì)算Wnt4 的相對(duì)表達(dá)量。

1.11 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用SDS裂解緩沖液洗滌和裂解SW620 和HCT116 細(xì)胞株，提取總蛋白。使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)確定蛋白濃度。然后將蛋白與上樣緩沖液混合，添加到每個(gè)通道進(jìn)行電泳。接著進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)定240 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h。然后固定蛋白，并分別與抗CHI3L1 抗體和抗wnt2/4抗體在4 ℃下孵育一夜。然后，用TBST 沖洗3 次后與二抗混合孵育1 h。最后，顯像及保存數(shù)據(jù)。

1.12 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 和Graphpad prism 8.0 軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHI3L1 在CRC 組織和癌旁組織中的表達(dá)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，與51 例癌旁組織相比，380例CRC 組織中CHI3L1 mRNA 顯著過(guò)表達(dá)（＜0.05），見(jiàn)圖1a。31 例配對(duì)樣本的分析也顯示了同樣的結(jié)果（＜0.05），見(jiàn)圖1b。此外，40 例CRC 組織與癌旁組織的免疫組化結(jié)果顯示，CHI3L1 在CRC組織及癌旁組織的表達(dá)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見(jiàn)圖1c。

圖1 CHI3L1 在CRC 組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 CHI3L1 過(guò)表達(dá)與輻射后CRC 細(xì)胞克隆形成比例 通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)CRC 細(xì)胞中CHI3L1 表達(dá)與輻射抵抗之間的相關(guān)性，分別以SW620 和HCT116 在0 Gy 條件下克隆形成數(shù)量為基準(zhǔn)，結(jié)果顯示，隨輻射劑量增加（0、2、4、6及8 Gy），細(xì)胞克隆形成比例減少，CHI3L1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞組在輻射后的細(xì)胞克隆形成比例顯著多于野生細(xì)胞組（＜0.05），見(jiàn)圖2a ～b。

圖2 CHI3L1 過(guò)表達(dá)與輻射后CRC 細(xì)胞克隆形成比例比較

2.3 CHI3L1 過(guò)表達(dá)與輻射后CRC細(xì)胞壞死數(shù)量隨輻射劑量增加，CRC 細(xì)胞核破壞量比例增加，CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞核破壞比例低于對(duì)照組，見(jiàn)圖3a ～b。不同劑量輻射后，CRC 細(xì)胞壞死率增加，CHI3L1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞壞死率明顯低于野生細(xì)胞組，見(jiàn)圖4a～b。

圖3 相對(duì)野生細(xì)胞組，不同劑量輻射后，SW620（a）、HCT116（b）細(xì)胞株中CHI3L1 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞核破壞減少，紅圈所指為破壞的細(xì)胞核

圖4 相對(duì)野生細(xì)胞組，不同劑量輻射后，SW620（a ～b）、HCT116（c ～d）細(xì)胞株中CHI3L1 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的壞死比例減少

2.4 CHI3L1 過(guò)表達(dá)可減少輻射引起的CRC 細(xì)胞增殖抑制和G2/M 期阻滯 隨輻射劑量增加，CRC細(xì)胞增殖比例降低，而CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖比例明顯高于野生細(xì)胞組，見(jiàn)圖5a ～b。輻射可導(dǎo)致CRC 細(xì)胞G2/M 期阻滯，CHI3L1 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞G2/M 期比例低于野生細(xì)胞組，見(jiàn)圖6a ～b。

圖5 相對(duì)野生細(xì)胞組，不同劑量輻射后，SW620（a）、HCT116（b）細(xì)胞株中CHI3L1 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖期比例增多

圖6 輻射引起大腸癌細(xì)胞G2/M 期阻滯。相對(duì)野生細(xì)胞組，不同劑量輻射后，SW620（a ～b）、HCT116（c ～d）細(xì)胞株中CHI3L1 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的G2/M 期阻滯比例減少

2.5 CHI3L1 通過(guò)上調(diào)Wnt4 表達(dá)導(dǎo)致CRC 細(xì)胞輻射抵抗 CHI3L1 過(guò)表達(dá)伴隨著Wnt4 蛋白表達(dá)的上調(diào)，而Wnt2 的表達(dá)情況沒(méi)有顯著改變，見(jiàn)圖7a。輻射可誘導(dǎo)CHI3L1 和Wnt4 蛋白的表達(dá)上調(diào)，且CHI3L1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞組的CHI3L1 和Wnt4 蛋白表達(dá)水平上升幅度較非過(guò)表達(dá)組增加更明顯，見(jiàn)圖7b。將siNC 或siWnt4 轉(zhuǎn)染到CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞中并進(jìn)行敲除效率驗(yàn)證，見(jiàn)圖8a～b；再次應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)輻射后CRC細(xì)胞克隆形成能力，顯示經(jīng)4 Gy 輻射后，Wnt4 敲除組的克隆形成比例顯著低于未敲除組（P ＜0.05），見(jiàn)圖8c。

圖7 CHI3L1 表達(dá)增加伴隨著Wnt4 表達(dá)水平的上調(diào)

圖8 經(jīng)4 Gy 輻射后，Wnt4 沉默組CRC 細(xì)胞的克隆形成比例較對(duì)照組明顯下降

3 討論

放射治療是局部晚期直腸癌綜合治療的重要組成部分，然而輻射抵抗逐漸成為療效影響因素之一[2-3]。筆者之前研究表明，CHI3L1 在CRC 細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)；CHI3L1 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖，影響CRC 細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的敏感性[10]。另有研究表明，CHI3L1 過(guò)表達(dá)的直腸癌患者在新輔助放化療后腫瘤緩解率較低[13]。筆者認(rèn)為CHI3L1 過(guò)表達(dá)可能參與了CRC 細(xì)胞的輻射抵抗，在本研究中通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)CHI3L1 mRNA 在CRC 組織中呈高表達(dá)。但免疫組化分析結(jié)果顯示，40 例配對(duì)組織樣本中CHI3L1 表達(dá)在CRC 組織中有增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），這與筆者之前研究的結(jié)果不一致[10]。認(rèn)為有以下3 個(gè)原因：（1）筆者前期研究樣本量只有15 例，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。（2）前期研究中免疫組化實(shí)驗(yàn)采用的不是組織化學(xué)評(píng)分半定量測(cè)量法，可能存在實(shí)驗(yàn)者主觀判讀的誤差。（3）CHI3L1 是一個(gè)分泌性的蛋白，癌細(xì)胞可能將其分泌到癌旁組織或外周循環(huán)中進(jìn)一步發(fā)揮作用，影響了癌旁組織的免疫組化染色結(jié)果。一項(xiàng)肝細(xì)胞癌中的研究表明，雖然CHI3L1 在HCC 組織和癌旁組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異，但癌旁組織中CHI3L1 過(guò)表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)；此外，血清CHI3L1 表達(dá)水平的高低也是影響肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后的重要因子[14]。

本研究進(jìn)一步揭示了CHI3L1 表達(dá)與CRC細(xì)胞輻射抵抗的關(guān)系。結(jié)果顯示，CHI3L1 過(guò)表達(dá)的CRC細(xì)胞在不同劑量的輻射后，細(xì)胞克隆形成比例明顯高于對(duì)照組，這表明CHI3L1 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的輻射抵抗。隨著輻射劑量的增加，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CRC 細(xì)胞的核破壞比例增加，且CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的CRC 細(xì)胞核損傷比例低于對(duì)照組。此外，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，隨著輻射劑量的增加，CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞壞死比例更高。由此可見(jiàn)，CHI3L1 可以通過(guò)減少輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死從而導(dǎo)致CRC 細(xì)胞的輻射抵抗。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的輻射后，CHI3L1 過(guò)表達(dá)組的CRC細(xì)胞中，增殖期細(xì)胞比例減少低于對(duì)照組；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)提示輻射可以使CRC細(xì)胞滯留在G2/M 期，且CHI3L1 過(guò)表達(dá)組中G2/M 期細(xì)胞占比較對(duì)照組減少，G0/G1 期細(xì)胞占比增加，這進(jìn)一步說(shuō)明CHI3L1 可以通過(guò)減弱輻射對(duì)CRC 細(xì)胞的增殖抑制和G2/M 期阻滯，從而導(dǎo)致輻射抵抗。

有研究表明，激活Wnt 信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞侵襲以及誘導(dǎo)輻射抵抗[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1過(guò)表達(dá)可以引起Wnt4 表達(dá)明顯上調(diào)，不同劑量輻射后，CHI3L1 表達(dá)升高伴隨著Wnt4 明顯上調(diào)，且在CHI3L1 過(guò)表達(dá)組中，Wnt4 的表達(dá)增加更為顯著。進(jìn)一步進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，Wnt4敲低組的細(xì)胞克隆形成比例減少高于未敲除組，提示W(wǎng)nt4 確實(shí)參與了CRC 細(xì)胞的抗輻抵抗，并且受CHI3L1 表達(dá)的調(diào)控。

綜上所述，CHI3L1 在CRC 組織中呈高表達(dá)，并參與CRC 細(xì)胞的輻射抵抗。CHI3L1 過(guò)表達(dá)可以減少輻射引起的CRC細(xì)胞壞死，減弱輻射導(dǎo)致的增殖抑制和G2/M期細(xì)胞阻滯；同時(shí)CHI3L1 通過(guò)上調(diào)Wnt4 表達(dá)促進(jìn)CRC 細(xì)胞的輻射抵抗。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 金銘：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)、論文修改、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；葉爽：數(shù)據(jù)整理；鄭真：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；劉開(kāi)泰：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)、論文修改、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、研究指導(dǎo)、經(jīng)費(fèi)支持