電針預(yù)處理對小鼠腦缺血再灌注時(shí)腦組織SENP3 表達(dá)的影響

張博，王旭璐，趙杰，趙岱雯

電針療法是在傳統(tǒng)針灸方法基礎(chǔ)上通以接近人體生物電的微量電流持續(xù)刺激，以防治疾病的一種療法。研究表明，電針預(yù)處理可增加腦缺血耐受，降低腦缺血再灌注損傷（CIRI），但具體影響機(jī)制不詳[1]。小泛素類修飾蛋白（SUMO）負(fù)責(zé)真核細(xì)胞生物體內(nèi)蛋白翻譯后修飾，稱為SUMO 化修飾[2]。SUMO 化修飾主要影響目的蛋白的活性、定位以及蛋白之間的相互作用[3]，其主要亞型SUMO2/3 修飾具有神經(jīng)保護(hù)功能[4]。SUMO化修飾特異性蛋白酶3（SENP3）可以對SUMO 化修飾的底物進(jìn)行可逆的去SUMO化，所以被認(rèn)為是修飾過程中的關(guān)鍵因子[5]。研究表明，SENP3 在脊髓損傷及腦缺血小鼠模型中高表達(dá)，并且證實(shí)SENP3 能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]。本研究擬探討電針預(yù)處理對小鼠CIRI 腦組織SENP3 表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用10 周齡的C57BL/6 健康雄性小鼠72 只，體質(zhì)量22 ～27 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號：SCXK（浙）2020-0001]。所有小鼠在層流動物房飼養(yǎng)，自由飲食，12 h 交替光照，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周。研究獲得浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將小鼠分為3 組（n=24）：假手術(shù)組（S組），正常暴露雙側(cè)頸總動脈，不夾閉；腦缺血再灌注組（I/R 組），動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈15 min 后再開放，建立小鼠CIRI 模型；電針預(yù)處理組（EA組），建模前根據(jù)“實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜”取百會穴（頭頂部兩耳連線中點(diǎn)），每天9：00 使用規(guī)格0.25 mm×25 mm 的毫針，于百會穴處皮膚平刺入2 ～3 mm，電針刺激頻率為2/15 Hz疏密波，電流刺激強(qiáng)度1 mA，電針刺激時(shí)間30 min，以刺激后引起輕微的肌肉收縮判定為有效刺激，1 次/d，連續(xù)5 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)造模 參考文獻(xiàn)[7]介紹的方法，造模前小鼠麻醉采用4%水合氯醛（0.15 ml/10 g），麻醉方式采用腹腔注射，在麻醉達(dá)成后將小鼠仰臥位固定于操作臺上，經(jīng)門牙栓線以充分暴露頸部。肥皂水消毒頸部，并剃除頸部毛發(fā)，碘伏再次消毒。于頸正中切開，仔細(xì)分離結(jié)締組織及肌肉組織，顯露并分離出雙側(cè)頸總動脈，掛線后輕微提起小動脈并使用小動脈夾夾閉，15 min 后松開小動脈夾恢復(fù)頸動脈血流。

1.4 染色法測定細(xì)胞凋亡率 3 組于再灌注4、8、12及24 h 各處死6 只小鼠，其中每組各取3 只處死的小鼠，麻醉達(dá)成后冰臺上斷頭取腦，迅速分離海馬組織并轉(zhuǎn)入液氮凍存。每組剩下的3 只處死小鼠，選擇大腦海馬CA1區(qū)組織制片檢測凋亡率，采用TUNEL 染色。進(jìn)行麻醉達(dá)成后開胸，顯露心臟，經(jīng)左心室依次灌注0.9%氯化鈉注射液和4%多聚甲醛，4 ℃冰面取海馬組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片。取3張連續(xù)切片常規(guī)脫蠟，按照Roche 公司的TUNEL 試劑盒（瑞士）說明書進(jìn)行操作，DAB顯色后在400 倍光鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒染色者標(biāo)記為凋亡細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取海馬CA1 區(qū)不重疊的5 個(gè)視野。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

1.5 海馬CA1 區(qū)SENP3 表達(dá)的檢測 取出凍存的每組3 只小鼠的海馬組織，采用Western Blot方法檢測海馬區(qū)SENP3 表達(dá)。加入少量液氮研磨，充分研磨后加入裂解液進(jìn)行裂解，4 ℃離心后取上清液，BCA 法測定上清液蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，置于100 ℃水浴鍋?zhàn)冃? min，置于―20℃凍存。配制10%分離膠和濃縮膠，每孔上樣6l后進(jìn)行電泳，蛋白完全分離后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST漂洗3 次，加入1 ∶5 000 稀釋的SENP3 兔多克隆抗體（Millipore 公司，美國），4 ℃搖床過夜。次日再次1×TBST 漂洗3 次后加入1 ∶10 000 稀釋的山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋科技公司，中國），室溫?fù)u床孵育1 h，最后經(jīng)ECL 發(fā)光，曝光顯影。顯影后的條帶圖像采用Quantity One 分析軟件（Bio-Rod 公司，美國）測定灰度值，以SENP3 條帶灰度值與內(nèi)參-actin 條帶灰度值的比值反映目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad prism7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)繪圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用F 檢驗(yàn)，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元凋亡率情況 3 組小鼠光鏡下海馬CA1區(qū)的病理結(jié)果見圖1 ～3。與S 組比較，I/R 組和EA組再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率顯著升高（t≥5.28，均P ＜0.05）；與I/R 組比較，EA 組再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率明顯降低（t≥5.30，均P ＜0.05），見圖4。

圖1 S組小鼠光鏡下海馬CA1 區(qū)的病理結(jié)果（HE染色，×400）

圖2 I/R組小鼠光鏡下海馬CA1 區(qū)的病理結(jié)果（HE染色，×400）

圖3 EA 組小鼠光鏡下海馬CA1 區(qū)的病理結(jié)果（HE 染色，×400）

圖4 3 組小鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

2.2 海馬CA1 區(qū)SENP3 蛋白表達(dá) 與S 組比較，I/R 組和EA 組再灌注各時(shí)間點(diǎn)SENP3 表達(dá)量均升高（t≥3.33，均P ＜0.05）；與I/R 組比較，EA 組再灌注各時(shí)間點(diǎn)SENP3 表達(dá)量顯著降低（t≥4.51，均P＜0.05），見表1。

表1 3 組小鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1 區(qū)SENP3 蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

CIRI 是一種非常敏感且進(jìn)展迅速的病理生理過程，該過程常由多因素介導(dǎo)，并迅速引起細(xì)胞能量代謝障礙、ROS 異常聚集、鈣離子超載及炎性因子激活等，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷[8]。研究發(fā)現(xiàn)，針刺百會穴可減少CIRI[9]，這為臨床CIRI的治療提供了一種新的方向。

SUMO 化修飾是一個(gè)高效的蛋白修飾方式，該過程通過與底物的異肽鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)，且這一過程是可逆的，打斷異肽鍵結(jié)合，阻斷這一進(jìn)程稱為去SUMO 化修飾（de-SUMOylation）。de-SUMOylation修飾的過程由SUMO特異性蛋白酶（SENPs或SUSPs）家族催化發(fā)生。SENP3 是SENPs 家族中分子量最小的成員，定位于核仁，研究表明SENP3 在CIRI過程中的表達(dá)增加并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。RNAi 介導(dǎo)的SENP3 基因敲除增強(qiáng)了SUMO2/3 的結(jié)合，減少了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與I/R 組比較，EA 組小鼠經(jīng)電針預(yù)處理后CIRI 期間SENP3 表達(dá)下調(diào)，這意味著增強(qiáng)了SUMO 化修飾，從而增加了細(xì)胞存活率。而電針預(yù)刺激時(shí)SENP3 的表達(dá)下調(diào)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，CIRI 時(shí)SENP3 表達(dá)升高，弱化了SUMO化修飾，細(xì)胞凋亡率增加，而電針預(yù)刺激可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與SENP3 的表達(dá)減少，增強(qiáng)了SUMO 化修飾有關(guān)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 趙杰、趙岱雯、張博：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；王旭璐、趙杰：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；張博、王旭璐：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持