?7 煙堿型乙酰膽堿受體調(diào)控線粒體自噬在膿毒癥急性胃腸損傷中的作用機制研究

費麗萍，陳志冬，陳金錦，朱冰楠，唐坎凱

全球每年新增膿毒癥患者人數(shù)達數(shù)千萬，且病死人數(shù)至少1/6[1]。膿毒癥常累及身體臟器損傷，引起多器官功能異常，患者病死風(fēng)險較高。腸道為最先累及臟器，亦為最有可能誘發(fā)膿毒癥的窗口。膿毒癥急性胃腸損傷（AGI）可導(dǎo)致機體營養(yǎng)不良、菌群失調(diào)及免疫功能紊亂，引起腸源性感染，進一步引發(fā)或者加劇其他臟器的功能異常，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。以往報道稱，7 煙堿型乙酰膽堿受體（ 7nAChRs）水平變化與膿毒癥患者炎癥控制及預(yù)后密切相關(guān)[2]。 7nAChRs 激動劑可以降低促炎因子合成水平，提高膿毒癥患者生存率。線粒體自噬受到抑制時，能夠使線粒體去極化，促進NLRP3 炎癥小體激活，提高活性氧物質(zhì)（ROS）、白介素1（IL-1 ）、IL-18水平，加劇促炎反應(yīng)[3]。當(dāng)前，鮮少有關(guān)于7nAChRs調(diào)控線粒體自噬的報道，本研究探究7nAChRs 調(diào)控線粒體自噬在膿毒癥AGI中的作用及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 2 500 倍電子顯微鏡，培養(yǎng)箱（廠家：美國thermo 公司），酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（購自上海恒遠生物科技有限公司），胎牛血清及胰蛋白酶（由美國GIBCO 公司提供），Dneasy Blood&Tissue Kit 試劑盒（購自美國sigma-aldrich），SYBR Green MIX試劑盒（購自德泰生物），RIPA裂解液（購自北京百奧萊博科技有限公司），bca試劑盒（購自鼎國生物技術(shù)有限公司），羊抗兔二抗、P62 一抗以及parkin 一抗（購自Santa Cruz 公司）。

1.1.2 動物與細胞 30 只清潔級大鼠，均為雄鼠，重量約200 g，6 月齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2018-0022。RAW264.7 細胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及模型建立 將大鼠隨機分為膿毒癥AGI 大鼠模型組（模型組）、模型+迷走切除組、假手術(shù)組（Sham 組），每組10 只。模型組：通過盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法構(gòu)建膿毒癥AGI大鼠模型；Sham組不做CLP，其他操作同模型組；模型+迷走切除組：開腹后將膿毒癥AGI 模型大鼠的迷走神經(jīng)前支及后支切斷，用有齒眼科鑷對腹腔動脈、腸系膜動脈與腹主動脈間分布的交感神經(jīng)節(jié)進行鈍性分離并做去除處理。術(shù)后6 h 取大鼠腸組織，制作超薄切片，進行脫水處理，采取醋酸鈾酰及檸檬酸染色，然后于電子顯微鏡下仔細觀察線粒體自噬空泡變化。于術(shù)后6 h取大鼠腸道組織，將其剪碎后制作成為組織勻漿液，使用酶聯(lián)免疫吸附法進行IL-1 、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF- ）的測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細胞放入含10%胎牛血清的改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）中，置于細胞培養(yǎng)箱（濕度恒定，溫度37 ℃以及5%CO2）進行常規(guī)培養(yǎng)，等細胞匯合度為70%～80%時開始傳代，采取含0.2%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶進行傳代消化，取對數(shù)期細胞完成后續(xù)試驗。在6 孔板上接種細胞，待其匯合度增至50%開始轉(zhuǎn)染。 7nAChRs siRNA組（n=3）：轉(zhuǎn)染siRNA- 7nAChRs 質(zhì)粒；陰性對照組（n=3）：轉(zhuǎn)染siCtrl 序列，兩組3 個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.3 mtDNA相對表達量檢測 收集細胞沉淀，加入Tricine-NaOH 緩沖液后采用玻璃勻漿器行勻漿處理；粗提線粒體DNA（mtDNA），接著用Dneasy Blood&Tissue Kit 試劑盒純化；使用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測mtDNA，選擇SYBR Green MIX 試劑盒，以mtDNA編碼形成細胞色素c氧化酶I（COI）反映mtDNA，內(nèi)參選擇核DNA 編碼的相應(yīng)18S rRNA，引物序列見表1。利用公式計算mtDNA 相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 P62、parkin 表達量檢測 收集培養(yǎng)的細胞，加入RIPA 裂解液予以裂解處理，然后提取總蛋白，采取bca 試劑盒完成蛋白測定。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并在恒流轉(zhuǎn)膜后，在其中加入P62 一抗、parkin 一抗，控制為1 ∶1 000，將其封閉過夜，并于室溫孵育2 h 后加入tris-hcl 緩沖液進行洗膜，然后繼續(xù)加入羊抗兔二抗（控制為1 ∶6 000），于室溫放置1 h，接著磷酸緩沖鹽溶液洗膜，予以化學(xué)曝光顯影處理，沖洗膠片，通過Gel-Pro_analyzer4.0 獲得灰度值，其中目的蛋白表達量為其灰度值與-actin灰度值的比值，重復(fù)3 次取平均值。

1.3 統(tǒng)計方法 使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行處理，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間使用獨立樣本t 檢驗，多組采取單因素方差分析。P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察 Sham組細胞內(nèi)線粒體較?。荒Ｐ徒M細胞內(nèi)線粒體變大，嵴變短變少；模型+迷走切除組線粒體轉(zhuǎn)化為空泡狀，見封三彩圖2。

圖2 電子顯微鏡下線粒體自噬空泡（醋酸鈾酰及檸檬酸染色，×2 500）

2.2 3 組IL-1 、IL-6、TNF- 比較 模型+迷走切除組、模型組IL-1 、IL-6、TNF- 水平高于Sham 組（均P ＜0.05），模型+迷走切除組高于模型組（均P ＜0.05），見表2。

表2 3 組IL-1 、IL-6、TNF- 比較

2.3 7nAChRs siRNA 組與陰性對照組mtDNA 比較 7nAChRs siRNA 組mtDNA 相對表達量高于陰性對照組（P ＜0.05），見表3。

表3 7nAChRs siRNA 組與陰性對照組mtDNA 比較

2.4 7nAChRs siRNA 組與陰性對照組P62、parkin表達量比較 7nAChRs siRNA 組P62、parkin 水平均低于陰性對照組（均P ＜0.05），見表4。

表4 7nAChRs siRNA 組與陰性對照組P62、parkin 表達量比較

3 討論

7nAChRs主要表達于機體免疫細胞，發(fā)揮著抗炎作用。線粒體通過自噬方式進行自身質(zhì)量控制，如果自噬受阻，將導(dǎo)致促炎反應(yīng)加劇[4]。本研究通過迷走切除術(shù)使7nAChRs失活，發(fā)現(xiàn)模型組細胞內(nèi)線粒體變大，嵴變短變少；模型+迷走切除組線粒體則轉(zhuǎn)化為空泡狀。這表明7nAChRs 失活可導(dǎo)致線粒體自噬減少?；罨癄顟B(tài)7nAChR可對microRNA-124形成起到誘導(dǎo)作用，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）mRNA 翻譯過程，降低IL-6 水平[5]。同時，microRNA-124 亦能抑制TNF- 轉(zhuǎn)換酶（TACE）基因翻譯，降低TNF- 表達水平[6]。TNF- 作為主要促炎因子，于胃腸炎性疾病產(chǎn)生機制中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，能夠刺激內(nèi)皮細胞分泌IL-1 等物質(zhì)[7]。IL-1可以通過自分泌及旁分泌刺激相關(guān)細胞因子、各種炎癥介質(zhì)合成，提高補體、吞噬細胞與NK細胞活性，加劇細胞免疫及體液免疫，最終誘發(fā)腸道炎性反應(yīng)。沈越等[8]研究指出，激動7nAChRs 能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。本研究模型+迷走切除組與模型組大鼠腸組織IL-1 、IL-6、TNF- 水平高于Sham 組，且模型+迷走切除組高于模型組，這說明7nAChRs失活可加劇膿毒癥AGI 腸組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃腸損傷加重。在巨噬細胞里面，7nAChRs 不僅能夠阻止核因子B（NF- B）激活，同時又能促進蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）-STAT3 激活，以此反向調(diào)控NF- B結(jié)合相應(yīng)靶向DNA，降低相關(guān)炎癥因子水平[9]。

7nAChRs 于心肌[10]、炎癥性腸病[11]中被證明了能夠增加細胞自噬能力。 7nAChRs 能夠通過降低巨噬細胞之中mtDNA釋放水平，對炎癥小體NLRP3產(chǎn)生抑制作用，進而減少IL-1 及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）合成與表達。本研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)巨噬細胞7nAChRs 的表達，mtDNA 相對表達量明顯升高，7nAChRs 能夠減少線粒體DNA 釋放。Parkin屬于線粒體自噬的一種標(biāo)志性蛋白，一旦線粒體受損，parkin將會識別受損線粒體表面E3 泛素連接酶，同時P62 能夠誘導(dǎo)parkin 大量聚集，并對細胞器自噬清除產(chǎn)生促進作用。以往研究指出，在受損線粒體清除過程中，P62 為重要介質(zhì)，可影響線粒體自噬快慢[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默巨噬細胞7nAChRs 基因能夠降低P62、parkin 表達水平，從而減少線粒體自噬。

綜上，7nAChRs 的失活能夠阻止線粒體自噬，使得膿毒癥AGI 患者腸道組織炎癥加重，其可能通過下調(diào)巨噬細胞P62、parkin等表達，提高mtDNA水平機制實現(xiàn)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 費麗萍：實驗操作、采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)、起草撰寫文章；陳志冬：獲取研究經(jīng)費、設(shè)計及實施實驗；陳金錦：實施研究、采集數(shù)據(jù)；朱冰楠：統(tǒng)計分析、查閱文獻；唐坎凱：指導(dǎo)研究過程、論文修改