腫瘤壞死因子?基因啟動子376 位點基因多態性與膿毒癥急性腎損傷及死亡的關系

劉鳳琪，唐坎凱，徐巍，褚利紅，朱冰楠

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應，急性腎損傷（AKI）是其常見嚴重并發癥，研究表明膿毒癥合并AKI 患者即使采用連續腎臟替代治療，90 d 病死率仍在50%以上[1]。AKI 出現多與炎癥介質失控性釋放及腎小管上皮細胞損傷相關，而腫瘤壞死因子（TNF- ）為膿毒癥合并AKI核心致炎因子，主要由巨噬細胞分泌，產生最快，達到高峰時間最早，且能刺激其他促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8 等產生[2-3]。TNF- 的編碼基因位于HLA Ⅲ類基因區內，TNF-多個位點具有多態性，而基因多態性與許多疾病的發生、發展有關[4]。有學者表明308 位點的GA、AA基因型與中心靜脈導管相關膿毒癥合并多器官功能障礙綜合征（MODS）的發生、發展相關[5]。而關于TNF- 基因啟動子376 位點基因多態性的研究較少，其在膿毒癥合并AKI 中的作用仍存在一定爭議。基于此，本研究探究TNF- 基因啟動子376 位點基因多態性與膿毒癥合并AKI 及死亡的關系，以期為臨床治療提供參考，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2020 年1 月至2022 年1 月在湖州市第一人民醫院就診的膿毒癥患者90 例，納入標準：符合膿毒癥診斷標準[6]，年齡＞18 歲。排除標準：（1）有手術史；（2）存在尿毒癥、腎移植者；（3）妊娠或哺乳期患者；（4）炎性腸病患者；（5）伴有血液學疾病患者；（6）入院前已存在AKI。按照是否合并AKI[7]，分為膿毒癥合并AKI組（58 例）和未合并AKI（Non-AKI）組（32 例）。本研究經湖州市第一人民醫院醫學科研與臨床試驗倫理委員會同意。

1.2 方法 TNF- -376 位點基因分型檢測：（1）取研究對象靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝真空采血器中，分離單個核細胞，鹽析法提取、純化DNA，置于－30 ℃低溫冰箱保存備用。（2）采用PCR 技術檢測基因型，使用TaqMan SNP 基因分型分析試劑盒（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,United States），上游引物：5’-CCCCTCCCAGTTCTAGTTCTATCTT-3’，下游引物：5’-CCTATTGCCTCCATTTCTTTTG-3’，使用探針為FAM-CTGTCTGGAAATTAGAAG（376 A），VIC-CTGTCTGGAAGTTAGAAG（376 G）。PCR 反應體系總體積為10l，含10×Buffer 1l，PCR 引物各5l、dNTP mixture 0.2l、Taq 聚合酶0.5 U、100 ng 模板DNA，加足夠無菌蒸餾水。反應條件：95℃預變性10min，變性95℃15s、60 ℃退火60 s，60 ℃延伸5 min，共40 個循環。PCR數據在Applied Biosystem 7500 RT-PCR ABI 上進行分析，TNF- 基因啟動子376 位點基因型分為GG型、GA 型、AA 型。

1.3 觀察指標（1）收集一般資料：年齡、性別、體質量指數（BMI）、膿毒癥死亡風險評分、收縮壓及舒張壓；（2）比較膿毒癥合并AKI 組及Non-AKI 組的TNF--376 位點基因分型；（3）比較不同基因分型患者的生存情況：觀察30 d，TNF- -376 位點不同基因分型患者的生存情況。

1.4 統計方法 采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t 檢驗；計數資料以率（%）表示，采用2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、BMI、膿毒癥死亡風險評分、收縮壓及舒張壓差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組TNF- -376 位點基因型和等位基因頻率比較 膿毒癥合并AKI 組與Non-AKI 組的GG、GA、AA型分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組等位基因攜帶率比較，差異亦有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組TNF- -376 位點基因型和等位基因頻率比較 例（%）

2.3 不同基因型患者的生存曲線分析 TNF- -376位點為GG 型患者的總生存率為50.00%，高于GA型及AA 型的26.92%、12.50%（Log-rank2=6.128、6.107，均P ＜0.05），見圖1。

圖1 膿毒癥組中TNF- -376 位點不同基因型患者的生存情況

3 討論

膿毒血癥是ICU 常見因感染引起的危急癥，病情兇險，可引起休克、多器官組織衰竭，是危重癥患者死亡的主要原因之一[8]。腎臟是膿毒癥的易損器官，據估計，高達50%～75%的嚴重膿毒癥患者在病程中出現AKI，而AKI 的出現會增加患者病死率[9]。炎癥反應是膿毒癥合并AKI 進展的主要原因之一，而TNF- 作為其主要啟動因子，在內毒素誘導的炎癥介質的瀑布樣釋放中起著重要作用[10-11]。有研究表明機體受刺激后TNF- 水平存在差異，而這種差異是基因決定的[12]。因此探究TNF- 基因啟動子376位點基因多態性，可能為未來治療提供新的靶點。

TNF- 是一種細胞因子，能夠產生多種表型及功能效應，其過量產生會降低膿毒癥患者的免疫功能及其他細胞功能，在急性炎癥狀態及膿毒癥中能夠預測疾病嚴重程度及并發癥的發展，而一些研究表明TNF- 水平與TNF- 基因表達的多態性相關[13]。TNF- 基因啟動子區域中238、308、376、489 位點均與膿毒癥中TNF- 產生有關聯[14]。本研究發現，膿毒癥合并AKI 組GA、AA 型的比例高于Non-AKI組，兩組等位基因攜帶率差異亦有統計學意義。這提示TNF- -376 位點的基因多態性與膿毒癥合并AKI 的發生相關。分析這可能是由于TNF- 可以通過刺激間充質干細胞（MSCs）增加細胞因子的釋放，參與腎組織中中性粒細胞的趨化、聚集及激活，并釋放大量氧自由基，進而導致腎小管上皮細胞的損傷，使得膿毒癥合并AKI，加重機體器官負荷[15]。但也有研究表明TNF- -376 位點的基因多態性與AKI的發生無關。這可能與患者的遺傳分布、種族及樣本量的不同有關[16]。本研究對患者生存時間的分析發現，TNF- -376 位點為GG型患者的總生存率為50.00%，高于GA型及AA型的26.92%、12.50%，這提示TNF--376 位點為GG型的生存率較高，GA、AA型可能為患者預后不良的重要預測因子。

目前序貫器官衰竭估計評分是用于評估膿毒癥、AKI等疾病損傷程度的相對精確的量表，具有客觀、數據易收集的特點，但是對于膿毒癥合并AKI的早期預測存在一定的局限性，特異性較差，且其計算繁復、難以快速使用[17]。本研究從基因層面考量，發現TNF- -376 位點的GA、AA 型患者膿毒癥合并AKI 發病率高，且預后較差，這提示需盡早對GA、AA 型患者采取預防措施、避免AKI 的出現。當然本研究也存在一定不足：研究為單中心研究，樣本量較小，且在樣本的選擇上存在一定偏頗，今后將聯合多中心，擴大樣本量，并將選擇不同地區人群，研究多個TNF- 基因啟動子位點，以提高研究的準確性及豐富性。

綜上所述，TNF- -376 位點的基因多態性與膿毒癥合并AKI 的發生有關，TNF- -376 位點為GG型的生存率較高，臨床需多關注GA、AA 型患者的情況，及時進行治療，改善其預后。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 劉鳳琪、朱冰楠：實驗操作、論文撰寫；徐巍、褚利紅：數據整理、統計學分析；唐坎凱：研究指導、論文修改、經費支持