子宮內膜癌組織血栓調節蛋白基因的表達及甲基化分析

朱穎捷，朱巍立

子宮內膜癌是以陰道出血或排液為主要臨床表現的病因尚未明確的婦科腫瘤疾病，發病人群呈年輕化趨勢。有研究認為異常DNA 甲基化[1]在子宮內膜癌發生發展過程中具有關鍵作用[2]，DNA 甲基化水平明顯升高，對于散發性子宮內膜癌具有較高的診斷價值[3]，周芮琪[4]則發現CHST11 低甲基化誘導子宮內膜癌的發生，且與臨床密切相關。近年來，血栓調節蛋白（THBD）基因受到研究者廣泛關注，認為THBD是一種新型抑癌基因，該基因表達失活與腫瘤的發展有一定關系，而THBD啟動子的低甲基化可能是導致該基因低表達的一個重要因素。本文通過850K 甲基化芯片測序、q-PCR 實驗及甲基化特異性PCR 技術，對THBD在子宮內膜癌和癌旁組織中的表達及THBD基因的甲基化水平進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 58 例子宮內膜癌及其癌旁組織取自2020 年12 月至2022 年6 月嘉興市婦幼保健院婦產科手術標本，取得標本迅速置液氮冷凍，－80 ℃冰箱保存備用。所有標本均經病理檢查證實，臨床資料完整，術前均未經放療、化療及性激素治療。患者年齡22 ～80 歲，中位年齡56 歲。病理診斷均為子宮內膜樣腺癌，按FIGO 標準進行病理組織學分級和手術病理分期，其中G1 級31 例，G2 級25 例，G3級2 例；Ⅰ期55 例，Ⅱ期1 例，Ⅲ期2 例。本研究經嘉興市婦幼保健院倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑購自索萊寶公司，DNA 提取試劑盒購自德國Qiagen 公司，重亞硫酸鹽試劑盒及MSP 試劑盒購自天根生化科技有限公司，TAE溶液購自Biosharp公司，引物序列購自金智唯公司，逆轉錄試劑盒及SYBR Green Master Mix試劑盒購自日本Takara 公司。

1.3 方法

1.3.1 850K DNA 甲基化芯片測序 選取本組患者中的10 例子宮內膜癌組織標本及癌旁組織，進行850K DNA 甲基化芯片測序，數據來源深圳中科普瑞基因科技有限公司。

1.3.2 qRT-PCR 檢測THBD mRNA 水平 Trizol 法提取各組織總RNA，所得RNAA260/A280 ＞1.7，符合純度要求，反轉錄合成cDNA。PCR 反應條件：95 ℃2min，95℃15s，60℃15 ～30s，共40 個循環，見表1。

表1 基因引物序列及內參

1.3.3 甲基化特異性PCR 檢測 采用DNA 甲基化修飾試劑盒對子宮內膜癌基因組DNA 進行甲基化修飾，具體操作按試劑盒說明書進行。PCR 反應體系：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火15～30s，72 ℃延伸20s共35 個循環，72 ℃延伸5min。擴增后產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察分析。THBD MSP 甲基化引物序列F：5’-TTTTTAGCGAAGAGTTTAATTTAGC-3’；R：5’-AACTAACCTACAATAACCAAACGAA-3’；未甲基化引物序列UF：5’-TTTTTAGTGAAGAGTTTAATTTAGTGG-3’；UR：5’-AACTAACCTACAATAACCAAACAAA-3’。擴增產物長144bp，MSP結果判定：僅擴增出甲基化條帶者為完全甲基化，僅出現非甲基化條帶者為未甲基化。

1.4 統計方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t 檢驗；計數資料采用2檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 850K DNA 甲基化芯片結果 10 例子宮內膜癌組織及癌旁組織呈高低甲基化趨勢，在DMP差異甲基化基因中發現THBD、ZSCAN4 等基因呈低甲基化趨勢（均P ＜0.05），見圖1。

圖1 甲基化芯片生信分析

2.2 MSP實驗結果 58例子宮內膜癌組織中有僅20例檢測到THBD基因啟動子的甲基化，發生率為34.5%（20/58）；在癌旁組織中有40 例檢測到甲基化改變，發生率為69.0%（40/58），THBD基因啟動子在子宮內膜癌中的甲基化水平明顯下降（2=13.81，P＜0.05），見圖2。

圖2 子宮內膜癌病灶及癌旁THBD 甲基化情況

2.3 THBD 在子宮內膜癌中的表達水平 以GAPDH 為基礎內參，結果顯示THBD 基因在子宮內膜癌中的表達明顯低于癌旁組織（t=15.36，P＜0.05）；內膜癌組織中非甲基化組較甲基化組THBD mRNA表達下降（t=4.25，P ＜0.05），見圖3。

圖3 THBD 基因mRNA 表達水平

2.4 THBD基因甲基化情況與臨床病理特征的關系THBD 甲基化發生率在絕經狀態、BMI 中差異均有統計學意義（均P＜0.05），但在病理分期、肌層浸潤深度及病理分期中差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表2。

表2 子宮內膜癌THBD基因啟動子甲基化與臨床病理特征的關系

3 討論

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一類上皮性惡性腫瘤，其發生發展是多因素的生物學過程，涉及多基因、多階段[1]。然而，目前尚不清楚其準確的發病機制，也缺乏特異性的分子標記物來早期診斷。因此，研究子宮內膜癌發病的分子機制和治療靶點尤為重要。

THBD是一種由557 個氨基酸組成的多功能跨膜凝血酶受體，是蛋白C途徑的關鍵調節因子，表達于內皮細胞、造血細胞和胎盤滋養層細胞等。THBD由位于20p11.21 染色體上的無內含子基因編碼，蛋白分子量為70 ～100 kD，其含有N-末端凝集素樣結構域、6 個表皮生長因子樣結構域、絲氨酸-蘇氨酸區、跨膜區和富含硫酸軟骨素的細胞質短尾。THBD的胞外區約有一半由珠蛋白N-末端組成，其序列與C型動物凝集素相似，它們參與腫瘤生長[5]和炎癥調節[6]。THBD 在多種人類腫瘤中異常表達，如間皮瘤[7]、肺癌及胰腺癌[8]等。許多實驗研究表明，THBD 在腫瘤細胞中的表達水平與腫瘤細胞增殖和體外侵襲呈負相關[9]。張小雨等[10]通過對結直腸癌及非癌組織進行甲基化熒光檢測，研究發現THBD 基因診斷結直腸癌的靈敏度及特異度分別為84.1%及87%，可以顯著區分癌組織及非癌組織，有望成為結直腸癌早診斷及早篩查的腫瘤標志物。有研究對141 例直徑小于6 cm的肝細胞癌切除病灶進行THBD免疫組織化學和臨床病理研究，提示THBD 可能通過抗凝作用抑制腫瘤細胞與門靜脈的黏附，從而阻止肝內轉移[11]。上述研究均說明THBD是潛在抑癌基因，其抗炎、黏附作用可抑制腫瘤的發病、侵襲及遷移。在本研究中，THBD 基因在子宮內膜癌組織中表達普遍下降，說明在子宮內膜癌發展過程中，THBD扮演重要角色，可能是子宮內膜癌發生的一個潛在生物標志物。

為了解THBD 基因啟動子甲基化水平，本研究采用MSP 檢測方法驗證850K 甲基化芯片測序結果，顯示與癌旁組織相比，子官內膜癌組織中THBD基因啟動子區呈明顯低甲基化水平。這提示THBD基因啟動子低甲基化可能是THBD mRNA 在子宮內膜癌組織中低表達的始發原因之一。值得注意的是，基因甲基化狀態常與癌癥的病理類型、臨床特性及分子表型有密切關聯，據此研究子宮內膜癌病灶甲基化程度有助于判斷腫瘤的惡性水平。但在本研究中，通過分析臨床資料發現患者絕經狀態、BMI與THBD 甲基化水平有關，這提示女性患者性激素水平下降及BMI 升高可能是某些抑癌基因表觀遺傳學改變的病因。因此，針對具有子宮內膜癌高危因素，如圍絕經期、肥胖等潛在發病人群，早期進行子宮內膜甲基化檢測或篩查，對預防腫瘤發生并早期干預具有重要意義。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突