不明原因復發性流產孕婦外周血中Treg及Th17細胞相關因子表達及其與妊娠結局的關系

劉春艷，季菲，盧文波，胡蓉敏，張莉英，鄭樂朋，許倩，楊秀萍

復發性自然流產（RSA）是指自上一次月經起至妊娠20 周前連續3 次或多次流產，1%～5%的育齡婦女會發生自然流產[1]。雖然遺傳、解剖、內分泌、感染和自身免疫異常已經被證實與RSA相關，但RSA病因及發病機制較為復雜，至今尚未明確，臨床上仍有約50%的患者流產原因不明，稱為不明原因復發性流產（URSA）。近年來研究認為URSA 約80%與免疫因素有關，并多數發生在早孕期。Treg 及Th17細胞是機體免疫調節的兩大重要細胞，Treg 和Th17細胞的相互作用影響URSA。Treg 細胞通過分泌免疫抑制因子發揮作用[2]，TGF- 1 是調控Treg 細胞分化發育最關鍵的細胞因子，FOXP3 是誘導和發展Treg 細胞所必需的轉錄因子。Th17 細胞是近年來研究發現的一種新型細胞群，ROR t 屬于核激素受體超家族成員，是控制Th17 細胞分化的關鍵轉錄因子，介導Th17 細胞的分化。本研究通過比較URSA孕婦治療前后以及不同妊娠結局外周血中Treg 及Th17 分泌相關細胞因子TGF- 1、FOXP3、IL-10、IL-17A 和ROR t 的表達，初步探討其與RSA 治療及妊娠結局的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年1 月至2022 年1 月寧波市婦女兒童醫院門診收治的URSA 孕婦40 例（觀察組）及正常孕婦24 例（對照組），年齡22 ～40 歲，就診時血HCG 升高及B 超可見妊娠囊及卵黃囊證實妊娠，早孕期抽取外周血。所有患者詳細記錄一般情況（年齡，身高，體質量，職業，教育水平，居住地環境，是否有吸煙、酗酒不良嗜好，測量血壓脈搏等基本生命體征）。URSA 孕婦納入標準：（1）有3 次或以上自然流產史，而無活產史；（2）夫婦雙方和/或胚胎染色體正常，無家族遺傳病史；（3）婦科、超聲和/或子宮輸卵管造影等檢查排除器質性病變和生殖器官解剖畸形；（4）月經周期正常，基礎體溫雙相，超聲監測排卵正常；（5）男方精液分析正常；（6）甲狀腺功能、血糖、胰島素等內分泌檢查均正常；（7）排除生殖道感染性疾病，如霉菌、支原體、衣原體等感染；（8）自身抗體（包括抗核抗體、抗心磷脂抗體、抗甲狀腺抗體、抗2-糖蛋白抗體等）均為陰性；（9）TORCH 5 項均為陰性；（10）全身免疫功能狀態檢查均正常；（11）微量淋巴細胞毒試驗陰性；（12）排除滋養細胞疾病、異位妊娠及人工流產。本研究經寧波市婦女兒童醫院醫學倫理委員會審批同意，且征求所有研究對象同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 根據妊娠結局分成妊娠成功組和妊娠失敗組，妊娠成功組孕婦維持妊娠至28 周以上，并分娩正常活嬰，B超提示宮內活胎，胎兒、胎盤、羊水均未見異常。妊娠失敗組孕婦孕28 周前出現胚胎停止發育、死亡等結局。治療方案參照我國《復發性流產專家共識（2016）》[3]中的診療標準，治療方案：每3周肌肉注射0.3 g 免疫球蛋白，至妊娠14 周。于早孕期治療前和治療后收集新鮮肝素抗凝靜脈血2 ml，分離血清并－70 ℃凍存，標本收集后同一批次檢測。ELISA 法分別檢測檢測轉化生長因子（TGF- ）、叉頭型基因P3（FOXP3）和轉錄因子維A 酸相關孤獨受體t（ROR t）吸光度，并根據吸光度值計算濃度。應用流式細胞儀檢測IL-10 和IL-17A 濃度。

1.3 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；兩組比較采用t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組一般資料比較 觀察組URSA孕婦流產次數為3 ～4 次，足月分娩0 次，平均年齡（30.0±4.1）歲；對照組正常孕婦流產0 次，足月分娩0 ～1 次，平均年齡（28.2±3.5）歲；兩組年齡差異無統計學意義（t=1.80，P ＞0.05）。

2.2 觀察組治療前后及對照組各因子表達水平比較觀察組治療前后TGF- 1、FOXP3、IL-10 水平差異均有統計學意義（均P ＜0.05），而IL-17A 和ROR t 差異無統計學意義（均P ＞0.05）；觀察組治療前TGF-1、FOXP3、IL-10、IL-17A 及ROR t與對照組差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；觀察組治療后ROR t及IL-17A 水平與對照組差異均有統計學意義（均P＜0.05），而TGF- 1、FOXP3 和IL-10 差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 觀察組治療前后及對照組各因子表達水平比較

2.3 觀察組不同妊娠結局各因子表達水平比較 觀察組最終妊娠成功26 例，妊娠失敗14 例，妊娠成功組TGF- 1、FOXP3 和IL-10 水平均高于妊娠失敗組（均P＜0.05），IL-17A 水平低于妊娠失敗組（P ＜0.05），兩組ROR t 水平差異無統計學意義（P ＞0.05），見表2。

表2 觀察組不同妊娠結局各因子表達水平比較

3 討論

Treg 及Th17 細胞是機體免疫調節的兩大重要細胞，二者相互作用影響URSA。Treg 細胞可能參與介導母細胞免疫耐受孕抗原的機制，可能有助于維持妊娠。Treg細胞通過分泌免疫抑制因子（如TGF-1 和IL-10）來表示免疫抑制[2]，這有助于抑制抗原提呈細胞和拮抗效應T 細胞，FOXP3 是誘導和發展Treg 細胞所必需的轉錄因子[1]。本研究發現URSA孕婦外周血TGF- 1、IL-10 和FOXP3 水平低于正常孕婦。筆者認為由于FOXP3 功能失控，Treg 分泌TGF- 1 和IL-10 數量的減少，其不能在妊娠中發揮正常的正向免疫調節作用，母胎免疫耐受受到影響，從而引起流產；且有研究發現可能和URSA 中Treg細胞數量減少以及Treg 功能降低有關[4-6]。

Th17 細胞是近年來研究發現的一種新型細胞群，對其研究已經擴大到移植排斥反應、宿主防御與腫瘤免疫等。Th17 細胞通過分泌炎癥細胞因子IL-17A、IL-17F 及IL-6 等在器官移植排斥反應的發生發展中起重要作用[6-7]。有研究表明正常孕婦外周血中Th17 細胞及其分泌的細胞因子水平較低[8-9]。本研究結果顯示，與正常孕婦相比，URSA 孕婦外周血中IL-17A 的分泌增加。有研究證實流產孕婦IL-17A的高表達可通過增加NF- b來減少孕酮受體的數量，并影響其功能，導致蛻膜發育不良和胚胎營養不足，從而流產[10]。ROR t 屬于核激素受體超家族成員，是控制Th17 細胞分化的關鍵轉錄因子，介導Th17 細胞的分化。本研究結果發現，ROR t 在URSA 患者外周血高度表達，因此推測ROR t通過調控Th17 細胞分化IL-17A，從而影響孕酮的分泌數量和功能，進而調控妊娠的進程，導致URSA 的發生。

免疫球蛋白治療URSA 的療效尚不明確，體外研究發現在T 細胞中加入免疫球蛋白后，Th17 細胞及其分泌細胞因子數量明顯減少，而Treg 細胞數量增加[11]。本研究采用免疫球蛋白規范治療后，URSA孕婦TGF- 1、FOXP3 和IL-10 水平水平均升高，同時上述細胞因子的表達和妊娠結局也密切相關，妊娠成功組的TGF- 1、FOXP3 和IL-10 水平水平均高于妊娠失敗組，而IL-17A和ROR t水平也呈降低趨勢。這表明免疫球蛋白可能通過活化Treg 促進細胞因子分泌調控URSA 孕婦免疫平衡，發揮著正向調節作用，從而維持母胎界面局部免疫耐受，TGF-1、FOXP3 和IL-10 水平降低預示著流產。

綜上所述，Treg及Th17 細胞相關細胞因子平衡紊亂與URSA 的發生及其妊娠結局有關，免疫球蛋白規范治療糾正這一紊亂可能是治療URSA的方案之一，綜合治療的機制仍在進一步探索中。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突