甘草次酸修飾的莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體的制備及表征

曾盈蓉　蔣婉婷　彭程　雷雨菁　夏新華

〔摘要〕 目的 優選甘草次酸修飾的莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體（GA-Cur-PF-Lips）的制備工藝，并對其理化性質進行表征。方法 采用乙醇注入法制備GA-Cur-PF-Lips，通過單因素考察和Box-Behnken響應面優化法優選其制備工藝；利用透射電鏡觀察其顯微形態，采用馬爾文激光粒徑儀測定其粒徑、多分散指數（polydispersity index， PDI）及Zeta電位，并對其體外釋放度、溶血性進行考察。結果 最佳工藝：脂質量85.19 mg，膽脂比1∶9.74，總投藥量4.5 mg，導脂比1∶40，超聲時間6.4 min（工作2 s、停2 s）。制得的GA-Cur-PF-Lips外觀澄清并伴有淡藍色乳光，透射電鏡下觀察呈類球形；其平均粒徑為（101.1±0.25） nm，PDI為0.170±0.011，Zeta電位為（0.333±0.060） mV，莪術醇包封率為86.65%±1.11%，芍藥苷包封率為47.85%±1.02%，總載藥量為1.233%±0.022%；體外釋放呈現緩釋特征，且無明顯的溶血作用。結論 優化后的GA-Cur-PF-Lips包封率高、粒徑小且分布均勻，無溶血性，且具有一定的緩釋作用，可為GA-Cur-PF-Lips進一步研發為低毒高效的抗肝癌新藥奠定基礎。

〔關鍵詞〕 莪術醇；芍藥苷；納米脂質體；乙醇注入法；Box-Behnken響應面法；理化性質

〔中圖分類號〕R283.6? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.011

Preparation and characterization of curcumol and paeoniflorin co-loaded nanoliposomes

modified by glycyrrhetinic acid

ZENG Yingrong， JIANG Wanting， PENG Cheng， LEI Yujing， XIA Xinhua

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To optimize the preparation process of curcumol and paeoniflorin co-loaded nanoliposomes （GA-Cur-PF-Lips） modified with glycyrrhetinic acid， and to characterize the physicochemical properties. Methods GA-Cur-PF-Lips were prepared by ethanol injection， and the preparation process was optimized by single-factor investigation and Box-Behnken response surface optimization method. The microscopic morphology was observed by transmission electron microscopy， the particle size， polydispersion index （PDI） and Zeta potential were measured by Malvern laser particle size analyzer， and the release degree and hemolysis were investigated in vitro. Results The optimum process was as follows： lipid weight was 85.19 mg， the ratio of cholesterol to phospholipid was 1∶9.74， the total dosage was 4.5 mg， the ratio of the guiding molecule to the lipid mass was 1∶40 and the ultrasonic time was 6.4 min （on for 2 s， off for 2 s）. The obtained GA-Cur-PF-Lips were clear with pale blue opalescence， and spherical in appearance under transmission electron microscope. The average particle size was （101.1±0.25） nm， the PDI was 0.170±0.011， the Zeta potential was （0.333±0.060） mV， the encapsulation rate of curcumol was 86.65%±1.11%， the encapsulation rate of paeoniflorin was 47.85%±1.02%， the total drug load was 1.233%±0.022%. Its in vitro release presented slow release characteristics， and there was no obvious hemolysis. Conclusion With high encapsulation rate， small particle size and uniform distribution， the optimized GA-Cur-PF-Lips have no obvious hemolysis， and have a certain sustained release effect. The experimental findings can lay a foundation for the further development of GA-Cur-PF-Lips as a new drug with low toxicity and high efficiency against liver cancer.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 curcumol; paeoniflorin; nano liposomes; ethanol injection method; Box-Behnken response surface method; physicochemical property

肝癌是世界范圍內癌癥死亡的主要原因之一，腫瘤細胞具有很強的增殖能力，且很容易轉移到身體的其他部位并產生有害物質，破壞正常器官結構，危害人類生命和健康[1-2]。莪術醇是近年來發現的新的抗腫瘤中藥單體之一，它與許多傳統化學抗腫瘤藥物相比，具有無致突變性、低毒、安全可靠的特點，并且對多種腫瘤有治療效果[3]，芍藥苷是一種水溶性單萜類糖苷，在抗腫瘤方面有廣闊的應用前景[4]。已有研究表明莪術醇和芍藥苷均能通過不同途徑和通路抗肝癌：莪術醇抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞衰老和凋亡[5-8]，芍藥苷可通過不同的分子機制誘導細胞凋亡、抑制增殖、侵襲和轉移[9-12]。

脂質體系指將藥物包封于類脂質雙分子層而形成的微型泡囊體[13]。脂質體擁有獨特的雙分子層結構，既無毒又可生物降解，且具有改善藥物溶解性，提高藥物穩定性，增強體內靶向性從而提高藥物療效等優點，被廣泛應用于腫瘤的治療[14]。肝癌多發生于肝實質細胞，研究證實該細胞表面存在大量的甘草次酸（glycyrrhetinic acid， GA）特異性結合位點[15]，脂質體經甘草次酸修飾后，對HepG2細胞具有更高的親和力[16]，從而提高了脂質體對肝癌細胞的靶向性。

前期預實驗發現莪術醇-芍藥苷（1∶1）聯用對HepG2細胞增殖的抑制有一定的協同作用，為此設計將莪術醇-芍藥苷共載于甘草次酸修飾的脂質體中，以便二者通過不同途徑和通路發揮協同作用，進一步提高其抗肝腫瘤效果。本文采用單因素實驗結合Box-Behnken設計-效應面優化法，對GA修飾的莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體（GA-Cur-PF-Lips）的處方與制備工藝進行了優化，以期為研發一種低毒高效的抗肝癌新制劑奠定制劑學基礎。

1 材料

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Precisa XB 220A型分析天平（瑞士Precisa重量分析股份公司）；01A418型超聲細胞粉碎機、SCIENTZ-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；ZNCL-G型智能磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-250B型恒溫培養箱（上海博泰實驗設備有限公司）；H3-20KR型臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）。

莪術醇對照品（批號：100185-201908，質量分數99.9%）、芍藥苷對照品（批號：110736-202145，質量分數94.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；莪術醇原料藥（批號：F17HB175748，質量分數98.0%）、芍藥苷原料藥（批號：M28GS143089，質量分數90%）、大豆卵磷脂（批號：T7011F127302））、D44 mm透析袋（截留相對分子質量8000～14 000）（上海源葉生物有限公司）；二硬脂酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA，西安齊岳生物科技有限公司）；膽固醇（批號20181128）、甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；無菌脫纖維兔血（批號210624，廣州鴻泉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA天地試劑公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；蒸餾水（華潤怡寶飲料有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1? 莪術醇與芍藥苷的HPLC含量測定

2.1.1? 色譜條件? （1）莪術醇：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%磷酸水-乙腈溶液（40∶60）為流動相；檢測波長為210 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL。

（2）芍藥苷：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水（14∶86）為流動相；檢測波長為230 nm；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

2.1.2? 對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的制備? （1）對照品溶液的制備：精密稱取莪術醇對照品適量，加甲醇稀釋制成每1 mL含5 μg的莪術醇對照品溶液。另精密稱取芍藥苷對照品，加甲醇稀釋制成每1 mL含10 μg的芍藥苷對照品溶液。

（2）空白對照溶液、供試品溶液與陰性對照溶液的制備：溶劑甲醇過0.22 μm微孔濾膜，作為空白對照，備用；精密移取GA-Cur-PF-Lips供試品1 mL，加入甲醇[17]（破乳劑）定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，備用。同樣方法處理空白脂質體樣品作為陰性溶液。

2.1.3? 專屬性試驗? 分別取“2.1.2”項下空白對照溶液、莪術醇對照品溶液、芍藥苷對照品溶液、GA-Cur-PF-Lips供試品溶液、陰性溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件分別進樣測定。結果表明，供試品色譜分別在與莪術醇、芍藥苷對照品色譜峰相應的位置顯相同的色譜峰，陰性對照均無干擾（見圖1—2）。

2.1.4? 線性關系考察? （1）莪術醇：精密吸取莪術醇對照品母液稀釋成質量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為Y＝15.709X+4.231 6，r2＝0.999 9，表明莪術醇在0.625～40.0 μg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

（2）芍藥苷：精密吸取上述芍藥苷對照品母液稀釋成質量濃度分別為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為Y＝14.311X，r²＝0.999 6，表明芍藥苷在1.25～80.0 μg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

2.1.5? 方法學考察? 分別進行精密度、穩定性、重復性、加樣回收實驗，結果表明，莪術醇和芍藥苷的精密度、穩定性、重復性實驗RSD均小于3%，符合要求；加樣回收莪術醇加樣平均回收率為101.84%±0.78%，芍藥苷加樣回收率是101.78%±0.67%，表明測定方法的準確度高。

2.2? 包封率和載藥量的測定

2.2.1? 包封率的測定? 采用透析法測定GA-Cur-PF-Lips包封率。精密移取pH=5的PBS 50 mL作為透析介質，吸取GA-Cur-PF-Lips 1 mL放入透析袋中，在25 ℃、磁力攪拌（300 r/min）下透析，分別于透析15、30、45、60、90、120、150、180 min時取透析液進樣測定。結果表明，隨著透析時間延長，透析介質中游離莪術醇與芍藥苷的峰面積均一直增加，從30～45 min期間，透析袋內外的莪術醇與芍藥苷呈現透析平衡狀態，而后透析介質中游離藥物逐步增多，說明脂質體結構開始被破壞，故確定透析時間為30～45 min（見圖3）。包封率按下述公式計算。

包封率（%）=（總藥量－游離藥量）/總藥量×100%

2.2.2? 總載藥量的測定? 精密移取2 mL GA-Cur-PF-Lips置于已干燥至恒定質量的西林瓶中，冷凍干燥 48 h，得凍干粉，稱量，計算供試品凍干粉凈質量。將凍干粉復溶后取1 mL樣品充分破乳后，按“2.1.1”項下色譜條件測定凍干粉中的莪術醇和芍藥苷的總藥量，計算總載藥量。

總載藥量（%）＝總藥量/凍干粉凈質量×100%

2.3? GA-Cur-PF-Lips的制備

采用乙醇注入法制備GA-Cur-PF-Lips。精密稱取芍藥苷2 mg溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=5）中作為水相，大豆卵磷脂80 mg、膽固醇20 mg、莪術醇2 mg溶于5 mL無水乙醇中作為油相，將油相預熱至60 ℃勻速滴入水相中，在磁力攪拌下（600 r/min）于60 ℃避光水合1 h后減壓旋蒸除去乙醇，經探頭超聲（200 W，工作2 s、停2 s）一定時間后定容，分別過0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。同樣方法制備空白脂質體樣品。

2.4? 制備工藝的單因素考察

2.4.1? 超聲時間的考察? 參照“2.3”項下方法制備脂質體，并分別考察不同超聲時間（3、6、9、12、15 min）對脂質體的影響。結果表明，隨著超聲時間的增加，粒徑呈現增大的趨勢，PDI與Zeta電位變化不明顯，芍藥苷與莪術醇的包封率則先增大后減小，兩藥包封率均在超聲6 min時達到最大值，故選擇超聲時間3～9 min做進一步優化。

2.4.2? 脂質量的考察? 通過預實驗摸索，選擇以大豆卵磷脂為原料，其他制備條件同“2.4.1”項，設計脂質量為20、40、80、120、160 mg分別進行考察。結果表明，隨著脂質總量的增加，粒徑總體呈現減小的趨勢，PDI升高，Zeta電位總體先升高后降低，包封率均呈現增大的趨勢，在脂質量為80 mg時兩藥包封率及各項指標均無較大變化，故選擇脂質量在40～120 mg做進一步優化。

2.4.3? 膽脂比的考察? 固定脂質量80 mg，水合溫度55 ℃，其他制備條件同“2.4.2”項，設計膽脂比（即膽固醇與大豆卵磷脂的質量比）為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14分別進行考察。結果表明，隨著膽脂比的減少（即膽固醇相對比例下降），粒徑總體呈現減小的趨勢，PDI總體呈減小趨勢，Zeta電位總體略有降低，包封率均呈現增大后減小的趨勢，在膽脂比1∶10時達最優值，故選取膽脂比1∶8～1∶12做進一步優化。

2.4.4? 總投藥量的考察? 固定膽脂比為1∶10，其他制備條件同“2.4.3”項，設計總投藥量為3、4.5、6、9 mg分別進行考察。由于莪術醇包封率約為芍藥苷的2倍，故將二者投藥比設為1∶2以使包封的莪術醇-芍藥苷接近1∶1，從而更好地發揮其協同作用。結果表明，總投藥量增加，平均粒徑、PDI、Zeta電位及莪術醇包封率無明顯變化，芍藥苷包封率則呈先升后降的趨勢，故選取總投藥量為4.5 mg進行后續實驗。

2.4.5? 導脂比的考察? 以二硬脂酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA）為導向分子，固定總投藥量為4.5 mg，其他制備條件同“2.4.4”項，設計導脂比（即導向分子與脂質量之比）為1∶80、1∶40、1∶20分別進行考察。結果表明，導脂比增加（即導向分子相對比例增加），平均粒徑、PDI呈上升趨勢，而Zeta電位和包封率則呈下降趨勢。考慮加入過少導向分子將影響其靶向性，而過多導向分子會引起包封率下降，甚至出現渾濁現象，故選擇導脂比1∶40進行后續實驗。

2.5? Box-Behnken響應面法優化工藝條件

2.5.1? 實驗設計及結果? 在前期單因素考察的基礎上，選擇影響較為顯著的脂質量（A）、膽脂比（B）和超聲時間（C）作為考察因素，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面優化法按排試驗，以芍藥苷包封率（Y1）、莪術醇包封率（Y2）和總載藥量（Y3）為評價指標，通過熵值法[18]對三指標進行賦權（Y1、Y2、Y3的權重系數分別為0.25、0.364、0.385）并計算綜合評分（Y）。因素水平、試驗設計及結果見表1—2。

2.5.2? 模型擬合及方差分析? 應用Design Expert 10.0.7軟件對表2實驗數據進行處理，以Y對A、B、C進行多元回歸，擬合得到二次多項式回歸方程：Y=79.79+7.12A-4.94B+2.33C+3.67AB-1.69AC+1.52BC-24.57A2-16.28B2-6.57C2。方差分析表明（表3），回歸模型P＜0.001，表明模型具有顯著性；失擬項P＞0.05，說明模型擬合良好；回歸方程擬合決定系數（r2）為0.959 6，校正決定系數（R2adj）為0.907 6，說明該模型可以解釋90.76%的響應值的變異，且方程擬合程度較好；模型變異系數為9.44%＜10%，表明模型準確度高；精密度值是有效信號與噪聲的比值，為13.588＞4，說明模型合理，表明該模型可用于設計分析。另外，脂質量（A）、膽脂比（B）對Y均有顯著性影響（P＜0.05），各因素之間交互作用不明顯，且各因素均不是單純的一次關系，而是二次關系（A2、B2、C2的P＜0.05）。以Y為評價指標對交互因素的響應面等高線圖及3D效果圖見圖4。

2.5.3? 驗證試驗? 基于上述建立的二次多項式回歸方程模型，通過Design Expert 10.0.7軟件得到最優工藝條件，即脂質量85.19 mg，膽脂比1∶9.74，超聲時間6.4 min。在此工藝條件下平行試驗3次，結果實測值與預測值較為接近，相對偏差較小，表明模型預測性良好，優選的GA-Cur-PF-Lips制備工藝穩定可行（見表4）。

2.6? 質量評價

2.6.1? 外觀及顯微形態? 按優化工藝制得的GA-Cur-PF-Lips，外觀澄清并伴有淡藍色乳光，透射電鏡下可見脂質體呈類球形，且飽滿圓整（見圖5）。

2.6.2? 粒徑與Zeta電位測定? 取適量脂質體，采用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀測定脂質體的平均粒徑和Zeta電位，結果表明：其平均粒徑為（101.1±0.25） nm，PDI為0.170±0.011，Zeta電位為（0.333±0.060） mV。

2.6.3? 體外釋放度考察? 采用透析袋法[19]考察莪術醇-芍藥苷的混合溶液與GA-Cur-PF-Lips的體外釋放情況。取5 mL脂質體溶液置于透析袋中，然后將透析袋置于含有100 mL釋放介質（PBS溶液，pH=5.0）的容器內，于37 ℃、150 r/min恒溫震蕩，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取樣1 mL（同時補充等溫等量釋放介質），測定莪術醇、芍藥苷含量，計算各時間點的累積釋放率并作圖。計算脂質體的累積釋放度[20]并繪制釋放曲線（見圖6）。

2.6.4? 溶血性考察? 參照2020版《中華人民共和國藥典》[21]的規定，對GA-Cur-PF-Lips的溶血性進行評估。取EP管18只，分為2組，分別為莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體組（Cur-PF-Lips）、GA-Cur-PF-Lips組，每組9只，對其進行編號（各組中1～6號管為供試品管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管，9號管為供試品對照管）。參考文獻[22]方案依次加入樣品、2%紅細胞混懸液、生理鹽水、去離子水，混勻后，立即置于（37.0±0.5） ℃的恒溫水浴中。3 h后觀察溶血和凝聚反應，肉眼觀察并拍照。同時取上清液于比色皿中，用紫外分光光度計于576 nm處測定其吸光度值，計算溶血率，溶血率低于5%為合格。結果表明，Cur-PF-Lips和GA-Cur-PF-Lips均未出現明顯的溶血及凝聚現象，其溶血率均小于5%，符合注射用藥要求，可以用于后續動物實驗的靜脈給藥（見表6）。溶血率計算公式如下：

3 討論

本研究以二硬脂酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA）為導向分子，利用其磷脂端（DSPE端）可嵌入到脂質體的脂質雙分子層實現對莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體的表面修飾，其GA端可與肝癌細胞膜上高表達的GA結合位點結合而使其具有肝腫瘤靶向性，其親水性PEG2000長鏈可增加脂質體的穩定性與體內循環時間，從而使莪術醇-芍藥苷能更大程度地的協同發揮抗肝癌作用。

為了評價GA-Cur-PF-Lips的藥物包封率，本研究前期曾采用葡聚糖凝膠柱色譜法、低速離心法、凝膠微柱離心法等方法分離脂質體與游離的莪術醇、芍藥苷，但均不能將其較好地分離，而透析法簡單快捷，能同時實現莪術醇與芍藥苷游離藥物與脂質體的分離，且回收率符合要求、結果可靠，因此，選擇透析法測定莪術醇與芍藥苷的包封率。

本研究較系統地考察了超聲時間、脂質量、膽脂比、總投藥量和導脂比多個因素對脂質體的粒徑、PDI、Zeta電位、莪術醇和芍藥苷的包封率影響，并在此基礎上采用Box-Behnken響應面優化法確定了GA-Cur-PF-Lips的最優工藝條件，即脂質量為85.19 mg，膽脂比為1∶9.74，總投藥量為4.5 mg，導脂比為1∶40，超聲時間為6.4 min（工作2 s、停2 s）。Box-Behnken響應面優化法具有具預測性好、實驗次數少、高效等優點，并能對各個影響因素及其相互作用進行分析[23]，故常用于制劑工藝條件的優化。本研究前期對脂質體制備的其他影響因素（如油水比、水相pH、水合溫度、水合時間等）也進行了考察，發現其他因素對脂質體的各項質量指標均無較大影響。另外，考慮到莪術醇和芍藥苷的包封率差異，將二者投料比設計為1∶2，可使脂質體包載的莪術醇-芍藥苷的配比接近1∶1，從而有助于二者發揮協同作用。

本研究制備的GA-Cur-PF-Lips具有粒徑小、分布均勻、外觀圓整等特點，較小粒徑的脂質體有更快、更強的腫瘤分布[24]；PDI小于0.3說明脂質體的粒徑分布均勻且狹窄，有助于提高其穩定性。體外釋放實驗顯示GA-Cur-PF-Lips具有緩釋特性，這將有助于延長藥物成分在體內的作用時間；溶血性實驗表明GA-Cur-PF-Lips與Cur-PF-Lips均無明顯的溶血與凝聚作用，故可注射給藥。綜上所述，本研究可為GA修飾的莪術醇-芍藥苷共載納米脂質體的進一步研究奠定基礎，同時對于研發低毒高效的抗肝癌新藥也具有一定的意義。

參考文獻

[1] YANG J Q， PAN G D， GUAN L J， et al. The burden of primary liver cancer caused by specific etiologies from 1990 to 2019 at the global， regional， and national levels[J]. Cancer Medicine， 2022， 11（5）： 1357-1370.

[2] LIU S Y， YAO M Z， LI X L， et al. Effects of circFOXO3 on the proliferation and invasion of liver cancer cells by regulating PI3K/Akt pathway[J]. Contrast Media & Molecular Imaging， 2022， 2022： 2109908.

[3] 李文杰. 莪術醇肝靶向脂質體的制備及其抗腫瘤研究[D]. 廣州： 廣州中醫藥大學， 2014.

[4] WANG X Z， XIA L， ZHANG X Y， et al. The multifaceted mechanisms of Paeoniflorin in the treatment of tumors： State-of-the-Art[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2022， 149： 112800.

[5] 黃嵐珍， 楊飛城， 陽? 晶， 等. 莪術醇誘導人肝癌HepG2細胞衰老及其機制研究[J]. 廣西植物， 2018， 38（7）： 894-902.

[6] 聶添情， 孟祥偉， 應宇晨， 等. 莪術醇及其衍生物的抗腫瘤活性研究進展[J]. 中草藥， 2020， 51（21）： 5613-5621.

[7] ZHANG R Z， ZHONG L， SUN K W， et al. A study on curcumol influencing proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through DJ-1/PTEN/PI3K/AKT pathway[J]. BioMed Research International， 2022， 2022： 9912776.

[8] ZUO H X， JIN Y， WANG Z， et al. Curcumol inhibits the expression of programmed cell death-ligand 1 through crosstalk between hypoxia-inducible factor-1α and STAT3 （T705） signaling pathways in hepatic cancer[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 257： 112835.

[9] 王昌高， 韋? 紅， 王裕宣， 等. 芍藥苷對肝癌HepG2細胞侵襲和遷移作用研究[J]. 中國臨床藥理學雜志， 2019， 35（15）： 1625-1628.

[10] 萬南燕， 蔣翠花， 高? 萌， 等. 芍藥苷調控JAK/STAT3通路干預HepG2細胞PD-L1表達的研究[J]. 中國藥科大學學報， 2019， 50（2）： 213-221.

[11] ZHOU Y， LIU X， GAO Y H， et al. Paeoniflorin affects hepatocellular carcinoma progression by inhibiting Wnt/β-catenin pathway through downregulation of 5-HT1D[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology， 2021， 22（9）： 1246-1253.

[12] LIU H， ZANG L L， ZHAO J， et al. Paeoniflorin inhibits cell viability and invasion of liver cancer cells via inhibition of Skp2[J]. Oncology Letters， 2020， 19（4）： 3165-3172.

[13] 侯? 婷， 陳? 軍， 蔡寶昌， 等. 硫酸銨梯度法制備脂質體的研究進展[J]. 中國藥師， 2009， 12（12）： 1723-1725.

[14] DE LEO V， MAURELLI A M， GIOTTA L， et al. Liposomes containing nanoparticles： Preparation and applications[J]. Colloids and Surfaces B， Biointerfaces， 2022， 218： 112737.

[15] SALVI M， FIORE C， ARMANINI D， et al. Glycyrrhetinic acid-induced permeability transition in rat liver mitochondria[J]. Biochemical Pharmacology， 2003， 66（12）： 2375-2379.

[16] DINH C T， VU H T， PHAN Q T H， et al. Synthesis of glycyrrhetinic acid-modified liposomes to deliver Murrayafoline A for treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Materials Science Materials in Medicine， 2022， 33（10）： 72.

[17] 席? 寧， 王永輝， 王麗森， 等. 線粒體靶向性的姜黃素TPP-PEG-PLGA脂質體的制備及促肝癌細胞凋亡研究[J]. 中國藥學雜志， 2022， 57（17）： 1438-1446.

[18] 麻學鋒， 呂逸翔. 張家界城鎮居民幸福水平對旅游城鎮化集聚的響應識別及測度[J]. 自然資源學報， 2020， 35（7）： 1647-1658.

[19] 張? 丹， 廖? 芳， 周? 潔， 等. Box-Behnken Design-響應面優化法優化芍藥總苷脂質體的制備工藝及體外釋放研究[J]. 中草藥， 2015， 46（3）： 359-364.

[20] 馮宇飛， 常書源， 秦國昭， 等. 星點設計-效應面法優化pH值響應及線粒體靶向雙功能金絲桃苷脂質體的處方及其體外評價[J]. 中草藥， 2020， 51（23）： 5934-5942.

[21] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 516.

[22] 吳斯宇， 曾盈蓉， 唐? 聘， 等. RGD環肽修飾的姜黃素/黃芩苷靶向共遞送納米脂質體的制備工藝優化及表征[J]. 中草藥， 2021， 52（22）： 6834-6844.

[23] 彭曉霞， 路莎莎. 響應面優化法在中藥研究中的應用和發展[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（19）： 296-299.

[24] MA S Y， LI M Y， LIU N， et al. Vincristine liposomes with smaller particle size have stronger diffusion ability in tumor and improve tumor accumulation of vincristine significantly[J]. Oncotarget， 2017， 8（50）： 87276-87291.