四磨湯對心力衰竭大鼠腸道菌群及氧化三甲胺的影響

周慧　肖長江　夏相宜　鄢磊　尹曉芳　莫凌　王孟可

〔摘要〕 目的 觀察腸道-氧化三甲胺（trimethylamine oxide， TMAO）-心力衰竭（heart failure， HF）軸上四磨湯對HF大鼠腸道菌群及TMAO的影響，初步探討四磨湯從腸道菌群方面防治HF的可能機制。方法 選用40只雄性大鼠，運用隨機數字表法分為對照組、四磨湯對照組、模型組、四磨湯模型組，每組10只。對照組、四磨湯對照組予生理鹽水2.5 mg/kg腹腔注射；模型組、四磨湯模型組予異丙腎上腺素2.5 mg/kg腹腔注射造模，4組大鼠連續4周腹腔注射結束后，連續灌胃治療2周。對照組、模型組予生理鹽水7.56 mL/kg灌胃，每日1次；四磨湯對照組、四磨湯模型組予四磨湯7.56 mL/kg灌胃，每日1次。使用液相色譜-質譜法檢測血漿TMAO，ELISA法檢測血清氨基端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP），16S rRNA檢測糞便樣本，生物信息學方法分析與比較樣品間的菌群結構特征。結果 模型組、四磨湯模型組TMAO、NT-proBNP含量均明顯高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），四磨湯模型組TMAO、NT-proBNP含量均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組相比，四磨湯對照組乳酸桿菌含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌含量明顯減少（P＜0.05）；模型組乳酸桿菌、普氏菌、雙歧桿菌含量均明顯減少（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯升高（P＜0.05）；四磨湯模型組普氏菌含量明顯減少（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組普氏菌含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯降低（P＜0.05）。結論 四磨湯可以降低HF大鼠TMAO、NT-proBNP含量，其機制可能與四磨湯改變HF大鼠腸道菌群、腸道-TMAO-HF軸相關。

〔關鍵詞〕 心力衰竭；四磨湯；腸道菌群；氧化三甲胺；氨基端前腦鈉素；生物信息學

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.006

Effects of Simo Decoction on intestinal flora and TMAO in rats with heart failure

ZHOU Hui XIAO Changjiang XIA Xiangyi YAN Lei YIN Xiaofang MO Ling WANG Mengke

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Hospital of Hunan

Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Simo Decoction on intestinal flora and trimethylamine oxide （TMAO） in rats with heart failure （HF） on intestinal-TMAO-HF axis， and to preliminarily explore the possible mechanism of Simo Decoction in preventing and treating HF from the intestinal flora. Methods Forty male rats were selected and divided into control group， Simo Decoction control group， model group and Simo Decoction model group by random number table method， with 10 rats in each group. The control group and Simo Decoction control group received intraperitoneal injection of normal saline 2.5 mg/kg; model group and Simo Decoction model group were given isoprenaline 2.5 mg/kg to establish model by intraperitoneal injection. After 4 weeks of intraperitoneal injection， the rats in 4 groups were continuously treated with gastric gavage for 2 weeks. The control group and the model group were given normal saline 7.56 mL/kg by gastric gavage， once a day; the Simo Decoction control group and Simo Decoction model group were given Simo Decoction 7.56 mL/kg by gastric gavage， once a day. liquid chromatograph-mass spectrometer was used to determine rat plasma TMAO， ELISA was used to measure N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） in rat serum， 16S rRNA was used to examine rat stool samples， and bioinformatics method was used to analyze and compare flora structure characteristics among samples. Results The TMAO and NT-proBNP content in plasma in model group and Simo Decoction model group was significantly higher than that in control group （P<0.05， P<0.01）， and the TMAO and NT-proBNP content in plasma in Simo Decoction model group was lower than that in model group （P<0.05， P<0.01）. Compared with control group， the content of Lactobacillus dramatically increased in Simo Decoction control group （P<0.05）， the content of Enterococcus decreased significantly （P<0.05）; the content of Lactobacillus， Prevotella and Bifidobacterium dramatically decreased in model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli increased significantly （P<0.05）; the content of Prevotella dramatically decreased in Simo Decoction model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the content of Prevotella dramatically increased in Simo Decoction model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Simo Decoction can reduce the content of TMAO and NT-proBNP in HF rats， and the mechanism may be related to the change of intestinal flora and intestinal-TMAO-HF axis in HF rats induced by Simo Decoction.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 heart failure; Simo Decoction; intestinal flora; trimethylamine oxide; N-terminal pro-brain natriuretic peptide; bioinformatics method

心力衰竭（heart failure， HF）是由多種原因導致的心臟結構和（或）功能的異常改變，使心室收縮和（或）舒張功能發生障礙，從而引起的一組復雜臨床綜合征，亦為各種心血管病的終末期表現。我國的HF患者基數大、發病率高。我國的心血管病患病率現在處于持續上升階段，2019年我國農村和城市因心血管病死亡的人數分別占總死亡人數的46.74%和44.26%，我國現有心血管病患病人數3.3億人，其中，HF 890萬人[1]。目前，我國的住院患者中的HF患者的平均年齡呈上升趨勢，感染是導致HF發作最常見的誘因，HF患者住院病死率為4.1%[2]。HF會引起多種病理反應，HF患者可有疲乏、無力、頭暈、食欲不振、腹部不適等表現。腸道假說暗示HF伴血流動力學改變，全身性充血增加可導致腸黏膜充血、水腫，黏膜屏障受損，從而導致細菌移位及循環內毒素增加，此種情況可能導致HF患者潛在炎癥發生[3]，使患者死亡風險增加。在某種程度上，腸道也被認為是人體的“功能器官”[4]。正常情況下，腸道菌群與人類宿主和諧共生，其具有幫助宿主獲取營養和促進免疫系統發育等功能[5]。但當腸道菌群出現紊亂時，也會與多種疾病的發生發展密切相關，如帕金森病、阿爾茨海默病、原發性高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病等[6]。

HF可引起腸道瘀血的病理改變。研究表明，HF患者的腸道菌群會發生改變，藥物可引起腸道菌群改變[7]，腸道微生物可能通過其代謝影響心臟的代謝健康[8]。研究發現，腸道代謝產物氧化三甲胺（trimethylamine oxide， TMAO）是參與HF進展強有力的預后標志物，調節腸道微生物群的組成和靶向腸道-TMAO-HF軸都可能對HF患者的生存產生深遠的影響[9]。氨基端前腦鈉素（N-terminal pro-brainnatriuretic peptide， NT-proBNP）因其成分穩定，可作為HF診斷和評估的生物學標記物。TMAO與HF相關死亡風險有關，TMAO和NT-proBNP的組合可為HF提供額外的預后信息[10]。有團隊研究發現，隨著HF的進展，患者TMAO的濃度逐漸增加[11]。因此，提出猜想，能否通過干預腸道菌群或相關酶來降低循環TMAO水平，從而影響HF患者的預后。

中醫藥對于治療疾病有療效佳，不良反應少的特點。研究證明，中醫藥能顯著調節腸道菌群失衡，促進有益菌生長，抑制有害菌過度繁殖，平衡有益菌和病原菌的數量，維持健康的腸道環境[12]。本課題組前期已對四磨湯進行了一些研究[13-15]，前期臨床研究發現四磨湯對改善HF的臨床療效確切有效[16]。因此，本研究選用腸道經典方劑四磨湯干預HF大鼠。本課題組選用的四磨湯由木香、枳殼、檳榔、烏藥4味藥組成，主要功效為降氣順逆，消積止痛。本研究欲探討四磨湯能否調節大鼠的腸道菌群及TMAO，以期為四磨湯防治HF提供更為明確的科學依據。

1 材料

1.1? 實驗動物

6～8周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質量200～220 g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2020-0008。分籠飼養于湖南省中醫藥研究院動物實驗中心，飼養溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。所有動物可自由獲得食物和水，普通飼料由湖南省中醫藥研究院動物實驗中心提供。本實驗通過湖南省中醫藥研究院醫學院實驗動物中心實驗動物倫理委員會認證，倫理批號：2021-0070。

1.2? 實驗藥物

四磨湯口服液（湖南漢森制藥股份有限公司，批號：2107118）；異丙腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：41210501）。

1.3? 主要試劑與儀器

NT-proBNP ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：L11031983）；糞便基因組DNA提取試劑盒（批號：#DP328-02）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（批號：#DP209-03）均購自北京天根生化科技有限公司；雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號：12640ES76）；磁珠（無錫百邁格生物科技有限公司，貨號：BMSX-200）。

超高效液相色譜儀（香港島津企業管理有限公司，型號：Nexera UHPLC LC-30A）；渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：XW-80A）；低溫高速離心機（型號：H1656R）、臺式高速冷凍離心機（型號：H1650R）均購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；超聲儀（杭州信儀科技有限公司，型號：JY92-IIW）；多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：MB-530）。

2 方法

2.1? 實驗動物分組與造模

所有大鼠經適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為正常組和造模組，每組20只。造模組采用異丙腎上腺素每日2.5 mg/kg腹腔注射，連續4周[17]。正常組腹腔注射生理鹽水每日2.5 mg/kg，連續4周。造模結束后，正常組隨機分為對照組和四磨湯對照組，造模組隨機分為模型組、四磨湯模型組，每組10只。

2.2? HF大鼠模型評估

造模結束后，對HF大鼠模型進行評估。

2.2.1? 大鼠一般情況? 正常組大鼠活動正常，無明顯特殊表現。造模組大鼠精神萎靡，安靜不欲動，進食減少，毛發光澤度降低。

2.2.2? 大鼠超聲心動圖情況? 從正常組和造模組中各隨機抽取6只大鼠，進行心臟超聲心動圖檢查。與正常組比較，模型組左室收縮末期內徑（left ventricular end diastolic diameter， LVEDD）、左室舒張期內徑（left ventricular end systolic diameter， LVESD）、室間隔厚度（inter ventricular septal diameter， IVSd）明顯升高（P＜0.01），左室射血分數（left ventricular ejection fraction， LVEF）明顯降低（P＜0.01）。造模組LVEF均值比正常組降低大于20%[18]并結合兩組的大鼠一般表現情況，可知造模成功。詳見表1。

2.3? 給藥方法

根據臨床70 kg體質量成人每日服藥量進行換算，四磨湯口服液成人每日所需總量為60 mL，換算后200 g大鼠每日所需重量為1.08 mL，即5.4 mL/kg[17]。四磨湯對照組、四磨湯模型組予四磨湯每日7.56 mL/kg灌胃[19]，對照組、模型組予生理鹽水每日7.56 mL/kg灌胃。各組均每日灌胃1次，灌胃2周。實驗期間因打斗死亡6只大鼠（模型組4只，四磨湯模型組2只）。每組隨機抽取6只進行后續的檢測。

2.4? HE染色觀察心肌病理變化

各組大鼠心肌石蠟切片常規脫蠟，再浸泡、脫洗、浸洗、染色、沖洗、脫水、封片，鏡下觀察組織形態。

2.5? 血清NT-ProBNP檢測

灌胃2周結束后，各組大鼠腹主動脈采集血清。采用NT-ProBNP ELISA試劑盒檢驗血清中NT-ProBNP的含量，具體操作嚴格按照所檢測指標對應的說明書進行。

2.6? 血漿TMAO含量檢測

灌胃2周結束后，每只大鼠腹主動脈使用紫色采血管采血得血漿。采用液相色譜-質譜法檢測大鼠血漿TMAO含量，用峰面積定量TMAO含量，峰面積越大，TMAO含量越多，峰面積無明顯有效單位[20]。按如下步驟進行：（1）取100 mol/L血漿與400 mol/L 甲醇/乙腈（體積比1∶1）渦旋30 s，超聲10 min（4 ℃水浴）；（2）在20 ℃下孵育1 h（促進蛋白質沉淀）；（3）在13 000 r/min（半徑7 cm）4 ℃下離心15 min；（4）取上清液，用真空濃縮器在4 ℃或室溫下蒸發至干；復溶100 mol/L乙腈/H₂O（體積比1∶1）；（5）渦旋30 s超聲10 min（4 ℃水浴）；（6）在13 000 r/min（半徑7 cm）和4 ℃下離心15 min；（7）取上清液進行檢測；（8）上液進行正向和反向色譜分離和質譜檢測。質譜分離相關參數設置如下：流速0.3 mL/min，進樣盤溫度4 ℃，柱溫40 ℃，色譜柱Waters HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）[H₂O（0.1%FA），Acetonitrile進樣量：3 μL]。

2.7? 腸道菌群的檢測

灌胃2周結束后，每只大鼠以提尾法取無菌糞便樣本0.5 g，置于10 mL無菌凍存管中，液氮冷凍后轉移至-80 ℃冰箱保存以備后續16S rRNA檢測。使用DNA提取試劑盒進行基因組DNA抽提，將大鼠糞便樣本純化，對樣本采用Illumina NovaSeq PE250進行16S擴增子測序，獲取下機原始數據（Raw Data）。對Raw Data進行去接頭、過濾、去重、堿基矯正以及去除嵌合體序列等操作，得到可以用于后續分析的有效序列。采用Qiime 2對數據進行處理。參考數據庫：silva-132-99，引物名稱：Bacterial V3/V4（341F+805R），引物序列：CTACGGGNGGCWGCAG、GACTACHVGGGTATCTAATCC。

2.8? 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以“ｘ±s”表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 心肌HE染色結果

對照組、四磨湯對照組HE染色顯示心肌細胞排列整齊、致密，細胞結構正常，形態完整，無炎性細胞浸潤；模型組可以看到心肌細胞結構破壞，形態紊亂，心肌細胞腫大和炎性浸潤；四磨湯模型組心肌細胞結構和形態仍有破壞，但較模型組明顯改善，心肌細胞腫大和炎性浸潤減少，說明四磨湯可對心肌有所改善，但其具體機制仍需進一步探討。詳見圖1。

3.2? NT-proBNP的檢測結果

與對照組相比，模型組、四磨湯模型組NT-proBNP含量均明顯增多（P＜0.01）。與模型組相比，四磨湯模型組NT-proBNP含量明顯減少（P＜0.01）。詳見表2。

3.3? TMAO的檢測結果

與對照組相比，模型組TMAO含量均明顯增多（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組TMAO含量明顯減少（P＜0.05）。詳見表3。

3.4? 各組大鼠腸道菌群變化

運算分類單元（operational taxonomic unit， OUT）是在系統發生學研究或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設置的同一標志。通常按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，每一個OTU通常被視為一個微生物物種，相似性小于97%就可以認為屬于不同的種。以下的分析均建立在此基礎上。每組送3份樣本進行相關測序。

3.4.1? Rarefaction稀釋性曲線? 根據抽到的序列數與它們能代表的數目構建曲線，即稀釋曲線。當曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理；反之則表明測序不足。本研究中稀釋曲線在15 000左右后趨于平穩，隨著抽取數量加大，曲線不再變化，說明本研究測序量足夠，可以覆蓋所有細菌物種，足以反應物種多樣性的真實情況，可進行下一步分析。詳見圖2。

3.4.2? Rank-Abundance曲線? Rank-Abundance曲線可反映物種豐度和物種均勻度兩個方面，物種豐度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐度越高；物種均勻度由曲線的形狀（平滑度）來反映，曲線越平坦，表示物種的均勻度越高。本研究可知四磨湯對照組大鼠的糞便的物種豐度最高，對照組、四磨湯對照組的物種豐度都大于400，模型組大鼠的糞便物種豐度最低，四磨湯模型組豐度較模型組高。其中對照組的物種均勻度最好。詳見圖3。

3.4.3? 韋恩圖? 根據分析各組間的OTU繪制韋恩圖。可知各組間共有OUT 256個，與對照組相比，其與四磨湯對照組共有404個，與模型組共有330個，與四磨湯模型組共有458個。對照組與四磨湯模型組共有OUT含量最多，與模型組共有OUT含量最少。四磨湯模型組特有的OTU為164，其特有數量最多，對照組100個，四磨湯對照組112個，模型組111個。說明模型組、四磨湯模型組與對照組在菌群種類和數量上有較大差別，其中四磨湯模型組較模型組與對照組相比差別更少，說明四磨湯可以改善HF大鼠的腸道菌群組成。詳見圖4。

3.4.4? 豐度熱圖? 為進一步直觀表現重要類群在不同樣本間的分布，以總豐度排名前20的ASV進行作圖，不同的微生物物種標記在縱軸上，橫軸表示為樣品編號，顏色偏紅表示含量偏高，顏色偏藍表示含量偏低。可知在門水平上的物種排名前四的為擬桿菌門（Bacteroidia）、厚壁菌門（Firmicutes）、毛螺旋菌（Lachnospirales）、彎曲菌門（Campilobacterota）。在屬水平上，含量較多的有普氏菌屬（Prevotella）、Muribaculaceae、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Lachnospiraceae_NK4A163_group、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、奎因氏菌屬（Quinella）、梭狀芽胞桿菌（Clostridia）。詳見圖5。

3.4.5? 基于屬水平各組大鼠腸道微生物物種（部分）分布情況? 腸道細菌的種類非常豐富，有研究發現增加有益菌的豐度可以調節人體腸道菌群微生物屬[21]。目前的相關研究顯示：在厚壁菌門（Firmicutes）[22]這一門類中，乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于“有益菌”，腸球菌（Enterococcus）屬于“有害菌”；在擬桿菌門（Bacteroidia）[23]這一門類中，普氏菌（Prevotella）屬于“有益菌”；在放線菌門（Actinobacteriota）這一門類中，雙歧桿菌（Bifidobacterium）[24]屬于“有益菌”；在變形菌門（Proteobacteria）在一門類中，主要為“有害菌”，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）。擬桿菌門（Bacteroidia）、厚壁菌門（Firmicutes）為腸道菌群的主要菌門，占據腸道菌群的95%以上，現選用以上乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）的含量進行分析。

與對照組相比，四磨湯對照組乳酸桿菌（Lactobacillus）含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）含量明顯減少（P＜0.05）；模型組乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）含量均明顯減少（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯升高（P＜0.05）；四磨湯模型組普氏菌（Prevotella）含量明顯減少（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組普氏菌（Prevotella）含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯減少（P＜0.05）。詳見表4。

4 討論

腸道菌群參與了人體眾多生理、病理過程[25]，它也被稱為“人體的微生物器官”。有研究表明，腸道菌群及其代謝產物可以直接參與人體正常的生理代謝活動，并通過炎癥、免疫、代謝等途徑參與心血管病的發展過程[26]。HF被認為與腸道菌群的改變相關[27]。降低腸道代謝或改變腸道菌群組成可降低HF的發生風險，而腸道菌群失調則促進HF的發生和發展。KUMMEN等[28]研究發現，慢性HF患者的腸道菌群成分變化大，細菌豐度降低。另一項支持性研究表明，通過高纖維飲食和補充醋酸鹽改變腸道菌群，改變腸道菌群可以預防高血壓和HF[29]。腸道微生物組研究已經確定，心血管病和HF中的一些共同特征，包括腸道微生物豐度降低和TMAO循環水平升高[30]。

本課題組肖長江教授主張“心病從脾論治”，其認為HF的病位主要在心，但卻不局限于心。在疾病的發生發展過程中，五臟可相互制約，相互影響，其他四臟功能的失調都能影響HF的疾病進程，五臟之中尤以心脾關系最為密切。肖長江教授認為可從調脾、健脾等方面治療HF[31]。國醫大師鄧鐵濤教授也認為HF與五臟相關，尤應顧護脾胃[32]。

心與小腸相表里，小腸主化物而分清別濁，其功能障礙必然會造成心血虛弱，心氣不足。研究表明，小腸為體內最主要的吸收器官，小腸的組織結構學特點為小腸的吸收創造了良好的條件，小腸的生理功能表現在小腸的運動、分泌、消化及吸收等方面，小腸功能失調可以選用益生菌進行治療[33]。在中醫學理論中，脾主運化，可將化生的水谷精微輸送全身，因此，中醫學的脾包括了現代醫學小腸的功能，現代醫學小腸的功能卻不能等同于中醫學的小腸。

HF病理狀態下[34]心血虧虛、心氣虧虛，不能推動血液正常運行見血脈瘀滯，脾失健運，加重病理產物痰濁、瘀血、水飲影響脾胃，運化功能減弱使得脾胃功能受阻。脾之消化、吸收等功能減弱，HF病理狀態下釋放的有害物質堆積于腸道可能引起腸道不適，導致腸壁水腫和腸屏障功能受損[3]，出現腹部脹滿等不適。HF會使每搏輸出量減少，從而引起體循環淤血，進而可出現腸道淤血、水腫，甚至缺血，使得腸道的正常結構與功能，正常的腸道微生物組成和含量發生改變[35]。

研究發現，服用益生菌或者發酵乳制品，可以直接影響人體腸道微生物構成[36-38]。特定的腸道微生物群依賴性途徑和下游代謝物都會影響宿主代謝和導致心血管病[39]。腸道菌群與靶器官的相互作用通過多種途徑發生，其中包括腸道-TMAO-HF軸[9]。TMAO為一腸道代謝產物，一項薈萃分析顯示顯示血漿TMAO水平與心血管風險和死亡率增加之間存在正劑量依賴關系[40]。

本實驗結果表明，經四磨湯干預后的HF大鼠體內NT-proBNP的含量較未干預的HF大鼠明顯減少，提示四磨湯可能對HF治療有促進作用。且經四磨湯干預后的HF大鼠心肌損傷也較未干預的HF大鼠少。HF大鼠體內TMAO較非HF大鼠明顯增多，而四磨湯干預后的HF大鼠TMAO較未干預的HF大鼠減少，提示HF狀態下TMAO會增加，四磨湯對HF大鼠體內的TMAO含量有負性作用。根據TMAO和NT-ProBNP與HF的相關性聯系[10]，四磨湯干預后的HF大鼠TMAO、NT-ProBNP均較未行干預的HF大鼠指標好轉，可驗證四磨湯確對HF有降低TMAO、NT-ProBNP的作用。提示四磨湯可能通過影響腸道代謝產物TMAO進而改善HF指標NT-ProBNP，這也驗證了心病與脾之功能密切相關。16S rRNA 結果顯示，四磨湯組的腸道菌群物種豐度最高，HF狀態下大鼠的腸道菌群的物種豐度明顯下降，四磨湯干預后的HF腸道菌群豐度較未干預的HF腸道菌群豐度升高。HF大鼠的TMAO、NT-ProBNP升高，可能與腸道菌群多樣性降低密切相關。各組樣本菌屬含量的變化也不盡相同，在觀察到的部分菌屬中，四磨湯干預的非HF大鼠乳酸桿菌（Lactobacillus）含量升高，腸球菌（Enterococcus）含量減少；HF大鼠腸道菌群里的乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）含量減少，腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量增高；四磨湯干預下的HF大鼠較非四磨湯干預的HF大鼠普氏菌（Prevotella）含量升高，腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量減少。可認為HF可減少“有益菌”的含量，增加“有害菌”的含量；四磨湯可增加“有益菌”的含量，減少“有害菌”的含量。這提示四磨湯可以改變腸道菌群的豐度和種類，對不同菌屬的改變也不是單一的。

綜上所述，四磨湯可以通過改變HF患者腸道中微生物種類和含量，降低腸道代謝產物TMAO含量，降低NT-ProBNP從而達到防治HF的目的。可以期望四磨湯對今后中醫藥“心病從脾胃論治”治療HF提供一個新的思路。在對腸道菌群的研究可知，微生物群可以為腸道微生物群如何促進HF提供新的見解，多種代謝物都會導致心臟病，TMAO可能只是冰山一角[41]。

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