防脫發中藥復方提取物生物活性分析

樂純琰　高天問　楊國蓉　賈鑫茹　丁濱　黃杰

【摘要】? 目的? 探究一個中藥復方提取物（至墨植萃粉，ZMD）防脫發，促進毛發生長的生物學機理。方法? 采用UPLC-MS/MS表征復方中的主要成分，采用網絡藥理學方法預測ZMD的生物活性；分別用CCK-8試劑盒和BODIPY染色測定細胞增殖活性，并觀察脂滴形態；通過熒光定量PCR檢測基因轉錄表達。結果? 質譜表征得到了60多個化合物，網絡藥理學預測這些化合物可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響毛囊周期；ZMD的乙酸乙酯部位（Peap）能夠促進HaCaT細胞的增殖、緩解細胞氧化應激反應、防止脂質蓄積，能上調Wnt10b、Wnt10a、β-catenin和AKT的轉錄。結論? 洗發水中藥復方提取物中的乙酸乙酯部位是可以通過AKT途徑促進細胞增殖活性，并可以通過p-AKT和Wnt10激活β-catenin的表達，進而延長毛囊生長期，達到防脫發的目的。

【關鍵詞】? UPLC-MS/MS；網絡藥理學；生物活性；Wnt/β-catenin 信號通路；AKT

中圖分類號? R285? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）01--04

最新調查數據顯示，中國目前有2.5億脫發人群，平均每6個中國人中就有1個飽受脫發困擾，且26～30歲是脫發的“高發”年齡段[1]，占比高達84%，較上一代人的脫發年齡提前了20年。脫發的低齡化趨勢推動了相關臨床防治和病理基礎的研究。脫發分為生理性和病理性兩類，生理性脫發是毛囊進入休止期后正常的脫落現象，每天有100～150根毛發脫落則屬于毛囊生理周期的自然結果[2]；病理性脫發則是臨床上的一種皮膚疾病。臨床上常見的脫發類型有雄激素性脫發[3]、斑禿[4]、瘢痕性脫發[5]、藥物性脫發[6]、頭癬[7]、營養不良脫發[8]等。由于病癥的嚴重程度及治療成本的差異，多數輕癥患者會選擇防脫發洗發水進行治療。2019年7月，《消費者報道》從京東、天貓兩個電商平臺收集了8款防脫洗發水的3.2萬條消費者評論數據，從消費者評論數據來看，目前市場上洗發水在防脫效果上表現一般[9]。近年來，隨著防脫洗發水需求的快速增長和一二線城市洗發水市場規模的迅速擴大，以中藥成分為主打的防脫發洗發水已占據了洗護市場28%的份額[10]。

國醫大師禤國維教授以中醫藥治療雄激素性脫發頗具特色，強調肝腎不足為其發病之根本[11]，用加味二至丸平補肝腎治其本，涼血清熱治其標[12]，療效顯著。本項目中的洗發水中藥復方就是在古方“二至丸”的基礎上添加首烏、桑葚、紅花等十幾味中藥材而制成。通過前期的試用反饋，有26.3%的受試者認為該洗發水能夠緩解脫發。中藥復方提取物化合物成分復雜，作用靶點多，為科學地闡述該中藥復方防脫發的生物學機制，本研究對該洗發水中藥復方提取物的化合物組分、生物活性部位進行初步探究。

1? 材料與方法

1.1? 材料和試劑

HaCaT細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺；中藥復方提取物（至墨植萃粉，ZMD）由杭州至墨生物科技有限公司提供；其他生化及化學試劑、培養基、特異性抗體等分別購自北京標譜檢測科技有限公司、德國Merck公司、杭州高晟生物科技有限公司、賽默飛世爾科技公司和武漢博歐特生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2? 儀器與設備

本研究用到以下設備：細胞培養箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）；全波長分光光度計（英國柏楉有限公司）；旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；Waters ACQUITY I-Class Plus UPLC超高效液相色譜系統（美國沃特斯公司）；SCIEX X-500R四極桿飛行時間質譜（美國AB SCIEX 公司）；實時熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 中藥復方制備及化學成分分析

采用200ml 45%乙醇溶解25g ZMD，依次加入等體積的石油醚、乙酸乙酯（去除乙醇后）、水飽和正丁醇溶液進行分級萃取，將分離得到的各萃取部位用旋轉蒸發儀旋干備用。配制濃度為1mg/ml的中藥復方供試品溶液。設置色譜條件：流動相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫程序：0～2.7min，99% B；2.7～8 min，99%～68% B；8～28min，68%～45% B；流速：0.3 ml/min；進樣盤溫度：8℃；柱溫：40℃；進樣量：3μL。設置質譜條件：飛行質譜ESI正負粒子掃描模式，進樣分析。根據化合物的一級精確質量數、同位素分布比和MS/MS搜索SCIEX OS配置的中藥二級數據庫TCM MS/MS Library（包含1000多種中藥化合物二級數據），完成對目標物的篩查。

1.3.2? 細胞模型的建立和指標檢測

將細胞按1×104 個/孔接種到96孔板中，加入含有10%小牛血清的MEM培養基培養過夜，分別用800μMH2O2、400μM油酸（OA）處理細胞構建抗氧化和脂質蓄積模型，用梯度濃度制備的復方各個部位處理不同模型，用CCK-8試劑盒檢測細胞活性、BODIPY染料進行細胞染色。

1.3.3? 網絡藥理學分析

利用TCMSP數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選中藥的有效成分及相應靶基因，構建靶基因數據庫；借助Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）尋找疾病基因；借助Venny 2.1.0平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得中藥復方活性成分與疾病的交集基因及韋恩圖；利用 Cytoscape3.8.2 軟件構建成化合物-關鍵靶點-疾病網絡圖并進行分析。

1.3.4? 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測相關基因表達

收集細胞，PBS洗3次后用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度并逆轉錄為cDNA。在八聯管中依次加入cDNA，雙蒸水，特異性引物和2X SYBR Green Mix，離心后放入熒光定量PCR儀，反應條件：預變性：94℃，5min；變性：94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，44個循環；延伸：72℃，5min。

1.3.5? 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件對所得數據進行分析處理。數據以均數±標準差表示，數據間采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 復方活性部位的細胞模型評價

分別用濃度為10～100μg/ml的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇和水溶部位處理細胞發現乙酸乙酯部位（Peap）和正丁醇部位（Pwnp）有促進細胞增殖的活性（見圖1 A、B，陰性結果未展示）。在氧化應激模型中，濃度為40、60、80μg/ml的Peap有顯著的緩解細胞氧化應激反應的活性（P<0.01）（見圖1 C），而Pwnp未出現保護效果（見圖1 D）。在脂質蓄積實驗中，與Ctrl組比較OA處理后造成的脂質蓄積明顯，Peap處理不會造成脂質蓄積，而且能夠顯著清除OA模型細胞中脂質蓄積（見圖2）。

2.2? 網絡藥理學預測

通過UPLC-MS對中藥復方Peap部位進行初步表征分析后，得到正離子模式下中藥復方歸屬的化學成分31個，負離子模式下中藥復方歸屬的化學成分38個。對表征的化合物進行網絡藥理分析共獲得207個中藥復方潛在靶點，與652個脫發相關的疾病靶點對比，獲得34個中藥復方—疾病交集基因（見圖3）。將此34個共同靶點和中藥復方潛在靶點輸入Cytoscape 3.8.2軟件中繪制出“化合物-關鍵靶點-疾病”相互作用網絡圖，圖中紅色代表疾病，藍色代表化合物，黃色代表34個共同靶點（見圖4）。將得到的34個交集基因借助STRING數據庫分別進行GO和KEGG分析，分別得到GO條目752個（P<0.05）和75條信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路高度聚焦。

2.3? RT-PCR檢測毛囊發育和細胞增殖相關基因的轉錄表達

與Ctrl組相比，Peap（40、60μg/ml）處理極顯著上調了細胞中Wnt10b、Wnt10a、β-catenin、AKT的轉錄表達，且低濃度效果較高濃度更明顯（見圖5）。

3? 討論

本研究中涉及的中藥復方提取物是一款防脫發洗發水中添加的主要活性成分，該復方由古方“二至丸”加味制成，目前尚未有對其防脫發的生物學機制的研究。經過液質聯用表征和網絡藥理學分析，我們推測弱極性部位可能是該復方提取物的主要活性部位，而作用靶點集中在誘導細胞分化的Wnt/β-catenin通路。我們用不同極性的溶劑將其進行逐級萃取分離，得到了石油醚、乙酸乙酯（Peap）、水飽和正丁醇（Pwnp）和水相四個部位，細胞活性實驗結果發現Peap和Pwnp兩個部位有促進細胞增殖的活性，而在氧化應激實驗中僅Peap（40～80 μg/ml）表現出顯著的抗氧化活性，因此在脂質蓄積實驗中我們僅對該部位的活性進行了研究，發現80μg/ml的Peap能夠顯著清除細胞中的脂質蓄積。通過上述研究我們推測Peap的活性濃度在40～80μg/ml范圍內。在接下來的研究中我們用RT-PCR方法證明了該濃度范圍Peap能調控Wnt/β-catenin通路。

大量研究證明，驅動毛囊干細胞從靜止期進入生長期可以有效防止脫發，而Wnt/β-catenin途徑參與了該過程[13]，其中p-AKT促進β-catenin的表達，從而使Wnt10a、Wnt10b的表達激增，進而延長毛囊生長期[14]，而我們通過網絡藥理學的分析也預測到Wnt/β-catenin可能是Peap的作用靶點之一，研究發現用Peap處理細胞促進了Wnt10a、Wnt10b和β-catenin表達，說明Peap可能同時通過Wnt10和AKT兩個信號通路疊加促進了β-catenin的表達。我們推測這與Peap中復雜的化學成分有關。因為AKT是通過傳遞磷酸化信號發揮調控功能的，因此這并不影響細胞增殖活性[15]。

中醫認為毛發的不正常脫落是體內臟腑經絡氣血的活動失調所致[16-17]。腎主骨，生髓充腦，其華在發，發的生長，賴血以養，故稱“發為血之余”[17]。當代年輕人生活節奏快，工作壓力大，脫發病因多以肝腎陰虛為根本，加之不規律的飲食及生活習慣導致[17]。二至丸出自《扶壽精方》，由等質量的女貞子和旱蓮草組合而成，女貞子采于冬至，而旱蓮草采于夏至，故名為二至丸[18]，具有補肝腎之陰的作用，在臨床上被廣泛用于肝腎陰虛所致的口苦咽干、失眠健忘、多夢易醒、頭昏頭痛、腰膝酸軟、月經不調、須發早白等癥[19]。有文獻報道，近年來二至丸（或加味二至丸）為臨床上治療脫發使用頻率較高的方劑[20]，且收效良好。但目前尚未有相關作用機制的研究，而我們的研究僅僅是對加味二至丸防治脫發的生物學機制的初步探索。

4? 參考文獻

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[2022-04-08收稿]