小麥光溫敏雄性不育系BS237ω-黑麥堿基因克隆及序列分析

侯起嶺　楊衛兵　婁紅耀　杜冰　高建剛　趙昌平　張風廷　秦志列

關鍵詞：小麥：光溫敏雄性不育系：ω-黑麥堿：基因克?。盒蛄蟹治觯喝槊訛a

中圖分類號：S512.1：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023） 03-0001-08

黑麥（Secale cereale L.）1R染色體短臂（1RS）取代普通小麥1B染色體短臂（1BS）形成的1BL/1RS易位系攜帶了抗葉銹、條銹和白粉病等優良基因，具有抗性好、豐產性好、適應性廣等優點，在育成的小麥品種中占有30％以上的比例。黑麥種子中的醇溶性儲藏蛋白被稱作黑麥堿（seca-lin），1RS的引入使編碼γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的Sec-I位點進入小麥基因組中，但同時也使其喪失了低分子量谷蛋白Clu-B3位點和小麥醇溶蛋白Gfi-B1位點，而黑麥堿不能補償因喪失低分子量谷蛋白亞基引起的谷蛋白聚合體數量減少，從而導致面團吸水性增大、穩定性和延伸性降低，小麥面團加工品質下降。1RS染色體上的ω-黑麥堿基因是導致小麥面團加工品質下降的重要原因之一。因此，充分了解小麥1BL/1RS易位系的ω-黑麥堿基因和蛋白的序列特征對改良小麥1BL/1RS易位系的加工品質有重要意義。

ω-黑麥堿由1R染色體臂上的Sec-1位點控制，該位點由緊密連鎖的多個基因組成，ω-黑麥堿基因家族包含大約15個成員。ω-黑麥堿是與ω-醇溶蛋白相關的一類小單體蛋白（45～ 50kD），富含谷氨酰胺，幾乎不含有半胱氨酸，無法參與鏈內或鏈間二硫鍵的形成。目前，許多ω-黑麥堿基因已經陸續從黑麥、小黑麥和小麥1BL/1RS易位系中克隆出來，這些ω-黑麥堿基因的氨基酸序列均是保守的，由信號肽、N端區域、重復結構域和C端區域組成。柴建芳等發現沉默ω-黑麥堿基因可以在不影響產量的前提下提高小麥1B/1R易位系的加工品質。張士昌等利用低能N+離子束誘變1BL/1RS易位系小麥種子，篩選出了9個ω-黑麥堿基因Sec-1位點表達缺失的新的1BL/1RS易位系種質。這些研究為改良小麥1BL/1RS易位系的加工品質和創制新的小麥1BL/1RS易位系種質提供了很好的思路。

乳糜瀉（celiac disease，CD）是一種由T-細胞介導的自身免疫性疾病，是因攝入小麥、大麥或黑麥中的面筋蛋白而引發的慢性小腸炎癥性疾病，具有基因易感性。目前，已鑒定出的能夠誘發乳糜瀉疾病的小麥蛋白肽段主要分布在醇溶蛋白中，主要類型是α-、β-和γ-醇溶蛋白，ω-醇溶蛋白中也含有部分肽段。小麥上報道的與CD相關的表位有5個來自α-醇溶蛋白，8個來自γ-醇溶蛋白，3個來自ω-醇溶蛋白.還有2個來自LMW-GS，1個來自HMW-GS。四肽序列PSQQ、QQPY、SPQQ、QQQP和PQQP與一系列腹腔活性肽共同存在，是潛在的毒性抗原表位，其中PQQP在谷物ω-黑麥堿氨基酸序列的可變重復區分布廣泛，PSQQ和QQQP目前在貧硫醇溶蛋白中還沒有被發現。

BS237是北京市農林科學院雜交小麥研究所選育的骨干不育系，具有育性徹底、配合力高、抗性好、農藝性狀優良等特點，但其ω-黑麥堿基因的詳細信息尚未有研究。鑒于此，本研究以BS237為材料，通過PCR法獲得具有完整開放閱讀框的ω-黑麥堿基因的編碼區序列，并進行序列比對和進化分析，同時對ω-黑麥堿中可能存在的T-細胞免疫肽段識別分析，以期為雜交小麥1BL/1RS類型不育系加工品質的分子改良和乳糜瀉疾病預防提供理論依據和參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用小麥不育系BS237由北京市農林科學院雜交小麥研究所提供，2022年6月從北京市農林科學院雜交小麥研究所順義基地（40°08′N，116°39′E）不育系繁殖圃收獲適量的BS237種子，供后續實驗分析使用。

1.2試驗方法

1.2.1 DNA提取 將小麥種子置于鋪有濾紙的培養皿中培養，1周后取適量葉片，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.2 引物設計及擴增 利用1RS特異引物Bmac0213-F/Bmac0213-R檢測BS237是否含有1RS片段，根據已注冊的ω-黑麥堿基因序列的保守區設計1對可擴增完整編碼區的引物ω-F／ω-R，詳見表1。

PCR反應體系：2×Taq Plus Master Mix 10μL，引物（10μmol.L-1）各1μL，模板DNA 2μL，ddH，0補充至20 μL。PCR擴增程序為：98℃預變性30 s;98℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環；720C延伸10 min。所有引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。采用諾唯贊生物（Vazyme Biotech）公司的2xTaq Plus Mas-ter Mix高保真酶，按說明書進行PCR擴增。

1.2.3 PCR產物純化及克隆測序 將擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行分離，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收目的條帶，與pEasy-Blunt Zero載體（北京全式金生物技術有限公司）連接，將連接產物轉化大腸桿菌Trans-Tl感受態（北京全式金生物技術有限公司），涂布于含Kan抗生素的LB培養基上，37℃倒置培養過夜。挑取一定數量的單克隆，用M13引物進行菌落PCR檢測，將陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4序列分析與進化分析 采用NCBI（ht-tps：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）和DNAMAN軟件對測序結果進行比對、拼接及翻譯。利用MegaX軟件（https：//www. megasoftware. net/）構建neigh-bor-joining系統發育樹。

2結果與分析

2.1 BS237的ω-黑麥堿基因的檢測、克隆及核苷酸序列分析

利用1RS特異引物Bmac0213-F/Bmac0213-R擴增BS237的DNA，得到524 bp的特異性條帶（圖1A），說明BS237是1BL/1RS易位系。利用引物ω-F／ω-R對BS237的ω-黑麥堿基因進行PCR擴增得到單一條帶（圖1B），對目的條帶進行純化和克隆測序，共得到8個具有完整開放閱讀框的不同基因序列（由TBtools軟件預測），可編碼333～357個氨基酸殘基。NCBI BLAST分析表明：克隆獲得的8個序列與已知的ω-黑麥堿基因序列的相似度在91%～100%之間，推斷其為ω-黑麥堿基因家族。將這8個序列提交GenBank，獲得的登錄號分別為OK999982～OK999985和OK999987～OK999990，其中，OK999982的長度為1002 bp，OK999985的長度為1050 bp，其余6個序列的長度均為1074 bp（表2）。

2.2克隆基因的推導氨基酸序列分析

本研究把克隆出來的8個ω-黑麥堿蛋白序列與已知的小麥1BL/1RS易位系（AMD09626.1）、六倍體小黑麥（ACQ83629.1）和黑麥（ACQ83628.1）的ω-黑麥堿蛋白序列比對，發現這8個蛋白的氨基酸序列結構均具有ω-黑麥堿典型的分子結構特征（圖2），即包含信號肽區（19個氨基酸）、N-端非重復區（12個氨基酸）、可變重復區和C-端非重復區（6個氨基酸）。與已知的ω-黑麥堿的核苷酸序列類似，本研究發現的8個序列在可變重復區富含谷氨酰胺（ glutamine，Q）、脯氨酸（pro-line，P）和苯丙氨酸（phenylalanine，F），但缺乏如半胱氨酸（cysteine，C）和甲硫氨酸（methionine，M）的含硫氨基酸：根據N-端非重復區起始3個氨基酸殘基的特性，這8個基因均屬于RQL型的ω-黑麥堿基因（表2）。

8個序列在N-端非重復區和C-端非重復區很保守，在信號肽區僅OK999984、OK999985和OK999987各存在1個氨基酸的替換，主要差異體現在可變重復區，且表現在氨基酸的替換和插入上（圖2）：OK999982與普通小麥1BL/1RS易位系中的ω-黑麥堿氨基酸序列（AMD0926.1）高度相似，只存在1個位點的氨基酸插入。其他7個序列與六倍體小黑麥的ω-黑麥堿氨基酸序列（ACQ83629.1）高度相似，其中，OK999983在1個位點存在氨基酸的插入，9個位點存在氨基酸的替換；OK999984在1個位點存在氨基酸的插入，4個位點存在氨基酸的替換：OK999985在1個位點存在氨基酸的插入，4個位點存在氨基酸的替換；OK999987在5個位點存在氨基酸的替換，在1個位點存在氨基酸的插入：OK999988在1個位點存在氨基酸的插入，在4個位點存在氨基酸的替換：OK999989在9個位點存在氨基酸的替換，在1個位點存在氨基酸的插入：OK999990在10個位點存在氨基酸的替換，在1個位點存在氨基酸的插入。

2.3ω-黑麥堿基因的進化分析

將克隆的ω-黑麥堿蛋白序列在NR數據庫中進行Blast，與GenBank中33個來自于9個物種具有完整編碼框的ω-黑麥堿蛋白、ω-醇溶蛋白和C-醇溶蛋白序列（表3）進行多序列比對并構建最大似然（maximum likelihood）系統發生樹（圖3）。根據ω-醇溶蛋白和ω-黑麥堿蛋白序列的相似程度分成3類：Clade 1、Clade 2和Clade 3（圖3）。Clade 1包含12個普通小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白，其中5個為普通小麥（Triticum，aestivum， L.）ω-醇溶蛋白（ATY51568，AAG17702，AG220259，ATY51554，AG220255），1個為烏拉爾圖小麥（T.urartu）ω-醇溶蛋白（AKB95614），4個為尾狀山羊草（Aegilops markgrafii）ω-醇溶蛋白（AFV52225，AFV52226，AFV52227，AFV52228），2個為野生二粒小麥（T.dicoccoides）ω-醇溶蛋白（AKA88516，AKA88509）。Clade 2中除了本研究克隆的8個小麥ω-黑麥堿蛋白還包含17個來自小麥、小黑麥和黑麥的ω-黑麥堿蛋白，其中5個為小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（AMD09626， ACQ83636， ACQ83642， ACQ83637，AMD09620），4個為六倍體小黑麥（AABBRR）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83629，ACQ83630，ACQ83631，ACQ83632），3個為八倍體小黑麥（AABBDDRR）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83633，ACQ83634，ACQ83635），5個為黑麥（Secale cereale L.）ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625，ACQ83626，ACQ83627，ACQ83628）。Clade 3包含了4個大麥（Hordeum vulgare L.）C-醇溶蛋白（AAB28161，AFM77749，CAA42642，AAA92333）。

根據相似度高低，Clade 2可以進一步分為4個亞組：Clade 2-1、Clade 2-2、Clade 2-3和Clade2-4。其中，Clade 2-1包含3個黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83626，ACQ83627，ACQ83628）和2個八倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83633，ACQ83635）。Clade 2-2包含3個本研究中克隆的ω-黑麥堿蛋白（OK999985，OK999988，OK999989），2個黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625）和1個六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83630）；OK999985與黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83624，ACQ83625）聚類在一起，OK999988和OK999989與六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83630）聚類在一起。Clade 2-3包含2個本研究中克隆的∞-黑麥堿蛋白（OK999983，OK999990），3個六倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83629，ACQ83631，ACQ83632），1個八倍體小黑麥ω-黑麥堿蛋白（ACQ83634）和3個小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（ACQ83636，ACQ83637，AMD09620）。Clade 2-4包含了3個本研究中克隆的ω-黑麥堿蛋白（OK999982，OK999984，OK999987），2個小麥1BL/1RS易位系ω-黑麥堿蛋白（AMD09626，ACQ83642）。

本研究克隆的8個ω-黑麥堿蛋白全部聚類在Clade 2中，與Clade 1中的普通小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白和Clade 3中的大麥C-醇溶蛋白不在同一類中，說明ω-黑麥堿基因與小麥族ω-醇溶蛋白基因和大麥C-醇溶蛋白基因親緣關系較遠，存在明顯的進化關系，具有基因組特異性。通過進化分析發現不同物種的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性，8個ω-黑麥堿基因大部分與小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性，OK999985與黑麥的ω-黑麥堿基因具有較高的同源性。

2.4克隆基因的T-細胞免疫肽段識別分析

CD毒性肽的識別分析結果（圖2，表4）表明，ω-醇溶蛋白中已知的T-細胞免疫肽Gli-ωt（PQQPFPQQ）在克隆的8個ω-黑麥堿蛋白中均有4～6個拷貝的分布，Gli-ω1（ PFPQPQQPF）在除OK999984和OK999987外的6個（1）-黑麥堿蛋白中各有1個拷貝的分布，Gli-ω2（PQPQQPF-PW）在克隆的8個ω-黑麥堿蛋白中均沒有分布。γ-醇溶蛋白中已知的T-細胞免疫肽DQ2.5-glia-γ5（QQPFPQQPQ）在8個ω-黑麥堿蛋白中有2～3個拷貝的分布；DQ2.5-glia-γ4c（QQPQQPFPQ）除了在OK999990中沒有分布，在其余7個ω-黑麥堿蛋白中均有1個拷貝的分布。3個四肽T-細胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）在8個ω-黑麥堿蛋白中均有分布，其中QQPY只有1個拷貝的分布，SPQQ有1～2個拷貝的分布，PQQP在8個ω-黑麥堿蛋白中分布數量較多，高達27～34個拷貝。

3討論與結論

通過對克隆的8個ω-黑麥堿基因推導的氨基酸序列比對分析得出，8條序列在可變重復區富含谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸，且谷氨酰胺：脯氨酸：苯丙氨酸大于5：4：1，這與小麥的ω-醇溶蛋白基因推導的氨基酸序列中的谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸的比例不一樣（4：3：1）。谷氨酰胺的數量最多（124～133），在不同序列間變化較大；脯氨酸的數量次之（91～102），除OK999982數量較少（91）外，其他序列間數量變化較小；苯丙氨酸的數量最少（22～24），8個序列間差異不大，比較穩定。8條序列中均不含有含硫氨基酸，沒有半胱氨酸和甲硫氨酸的分布，這與前人的研究結果一致，這種特有的序列特征表明ω-黑麥堿蛋白不能在自身內部和其他蛋白質形成鏈間連接，可能具有獨特的功能。

根據系統進化樹發現克隆的8個ω-黑麥堿基因在小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥和黑麥間存在高度同源性，表明該基因家族在黑麥R染色體或整個黑麥基因組與小麥或小黑麥基因組整合后變異較少，具有基因組特異性。

CD毒性肽的識別分析表明，有3個四肽T-細胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）分布在8個ω-黑麥堿基因中，其中PQQP在每個基因的分布數量高達27～34個拷貝，這說明ω-黑麥堿基因可能是導致乳糜瀉癥狀發生的主要基因之一。在未來小麥育種中研究小麥1BL/1RS易位系的T-細胞免疫肽段類型、活性特點以及ω-黑麥堿與人類乳糜瀉癥狀之間的關系對優質小麥和優質雜交小麥選育具有重大意義。

可以通過操縱ω-黑麥堿基因已知的遺傳信息來降低其基因表達量，進一步改善小麥1BL/1RS易位系的品質。任燕等認為反義RNA雖然可降低黑麥堿的表達量，但利用反義RNA去除由Sec-1位點產生的所有RNA來降低黑麥堿含量的方法可能難以實施。研究表明，可以通過降低或沉默ω-黑麥堿基因Sec-1位點的表達，創制Sec-1位點缺失的突變體或者利用RNA干擾或基因編輯技術降低甚至沉默∞-黑麥堿基因的表達來實現。同時，在1RS末端導入Glu-B3和Gli-B1位點，可以改善1BL/1RS小麥面團的加工品質。育種過程中配置雜交組合時，如果親本有一個為非1BL/1RS易位系，含有1RS的雜交后代品質受到的負面影響也可被掩蓋，用1BL/1RS易位系含有高分子量谷蛋白亞基5+10的品系制作的面包體積最大，面團強度也最大。因此，往小麥1BL/1RS易位系導入優質高分子量谷蛋白亞基或者與非1BL/1RS易位系雜交也可以改善小麥1BL/1RS易位系的加工品質。

在雜交小麥優質不育系的選育過程中，應該進一步明確親本材料的遺傳背景，注重早代材料的鑒定，加強非1BL/1RS小麥易位系種質資源的使用，還可以利用骨干不育系與優質小麥種質資源多配置組合，逐步改良雜交小麥不育系的品質特性。此外還可以通過創制Sec-1位點缺失的1BL/1RS小麥不育系來改良雜交小麥的加工品質。

本研究從BS237中克隆了8個具有完整開放閱讀框的ω-黑麥堿基因，與前人研究結果相符。根據其N-末端序列的前3個氨基酸殘基的特點，這8個基因均屬于RQL類型；與已知基因的比對分析表明，不同ω-黑麥堿基因在N-端非重復區和C-端非重復區序列相對保守，在中間可變重復區存在氨基酸的替換和插入；進化分析發現，這8個ω-黑麥堿基因很保守，在黑麥R染色體或整個黑麥基因組與小麥或小黑麥基因組整合后變異較少，與小麥1BL/1RS易位系、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥和黑麥間存在高度同源性，與小麥及其祖先種的ω-醇溶蛋白基因和大麥C-醇溶蛋白基因親緣關系較遠。CD毒性肽的識別分析表明，已知的分布于ω-醇溶蛋白中的T-細胞免疫肽Gli-ωt（PQQPFPQQ）、分布于γ-醇溶蛋白中的T-細胞免疫肽DQ2.5-glia-γ5（QQPF-PQQPQ）、3個四肽T-細胞免疫肽（PQQP，QQPY，SPQQ）在8個基因中均有分布，其中PQQP在每個基因分布的拷貝數高達27及以上，可能導致潛在的人類乳糜瀉毒性。