蘿卜種質親緣關系的分子標記分析

劉辰　付衛民　劉賢嫻　徐文玲　郭棟　王淑芬

關鍵詞：蘿卜：親緣關系：分子標記；遺傳多樣性：聚類分析

中圖分類號：S631.101 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023） 03-0022-08

蘿卜（Raphanus sativus L.）屬十字花科蘿卜屬，是一種非常重要的蔬菜作物，不僅營養價值豐富，且具有廣泛的用途，其肉質根可作為蔬菜鮮食和制干食用，葉和種子皆可入藥，食用、藥用和保健價值較高。大、中型蘿卜主要分布在亞洲地區，尤其是中國、日本和韓國等。我國作為蘿卜的起源地之一，產區分布很廣，幾乎每個地區都有種植，而且擁有世界上最為豐富的種質資源。蘿卜的類型十分多樣，可以根據葉形、根形、皮色肉質色、栽培季節、用途等進行分類，目前我國國家蔬菜種質資源庫中保存的蘿卜種質資源已超過2000份。

種質資源是開展育種工作的基礎，只有充分了解蘿卜種質資源的遺傳多樣性，才能更有效地純化和利用種質開展品種選育工作。早期對蘿卜種質遺傳多樣性的分析方法是建立在形態水平上的，一般根據葉型、根形、根皮色、肉質色、抗逆性、抗病性、風味等可以測量、易于觀察的特征進行分類。這類方法雖然相對簡單、易于操作，但存在形態標記數量較少且容易受環境條件、觀察者主觀因素等影響。之后，國內學者采用生理生化水平的技術方法對蘿卜種質資源進行分析，如用同工酶、硫代葡萄糖苷等指標作為標記對來源于國內外的種質進行分類。這類方法具有標記指標數量多、不易受環境影響等優點，已被廣泛用到很多物種的遺傳多樣性研究中。

近年來，隨著分子生物技術的不斷發展，大量的分子標記被開發出來，由于具有成本低、重復性好、標記數量多等優點，越來越多的種質遺傳多樣性分析開始采用分子標記。在蘿卜的相關研究中，較早應用的是RAPD、AFLP等類型的標記，但隨著標記數量的增多和種類的豐富，SSR、ISSR等更易于操作的標記已成為目前采用較多的標記類型。國內外已有利用分子標記技術對蘿卜種質資源親緣關系進行分析的報道，但多是對不同種質進行分類或是對某一特定類型種質進行的分析，而且選用的種質類型各不相同，材料數量也從幾份到幾十份不等，因此得到的結果并不完全一致。本研究用來源于國內外不同國家和地區的108份蘿卜種質為試材，對分布在整個基因組上的118個標記進行了篩選，獲得56個多態性好的標記并用于分析蘿卜種質的親緣關系，以期為更好地評價種質資源、了解其遺傳進化關系進而指導品種選育工作提供數據支持。

1材料與方法

1.1試驗材料及引物

1.1.1試驗材料 本研究選用的108份不同類型蘿卜種質（表1），包括綠皮綠肉類型30份、綠皮淡綠肉類型6份、綠皮白肉類型3份、心里美類型6份、紅皮白肉類型19份（其中2份為穿心紅類型）、淺紅皮白肉類型1份、黑皮白肉類型1份、白皮白肉類型34份、紅皮白肉類型櫻桃蘿卜6份、白皮白肉類型櫻桃蘿卜2份，均由山東省農業科學院蔬菜研究所蘿卜課題組提供。所有種質的種子經催芽后，在鋪有濾紙的小培養皿中培養（23℃，光周期為16 h光照/8h黑暗），待子葉完全展開時取樣，每份材料隨機從5個單株上摘取嫩葉，保存于-20℃冰箱備用。

1.1.2試驗所用引物 本研究所用引物全部來源于蘿卜的參考基因組網站（http：//radish-ge-nome.org/），其中SSR引物27對，InDel引物80對，IBP引物11對。引物用無菌水稀釋到10μmol/L，-20℃保存備用。

1.2 DNA提取

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，DNA提取質量通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA濃度利用紫外吸收法進行檢測，根據檢測的濃度情況用ddH，0稀釋至10ng/μL，置于-20℃冰箱保存備用。

1.3 PCR擴增及檢測

本研究所用PCR反應體系總體積為10μL：2×Taq PCR Mix 5μL，正反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH20 3μL。PCR反應程序為：94℃預變性3 min;94。C變性30 s，55。C退火30 s，72℃延伸1min，25個循環：72℃充分延伸5 min;4℃保存。擴增產物經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。選擇條帶清晰、多態性好的標記進行數據統計及后續分析。

1.4數據統計分析

根據電泳檢測結果，選擇清晰且容易分辨的條帶進行統計，有條帶記為1，沒有條帶記為0，缺失條帶記為9，在Microsoft Excel 2013中記錄統計結果，建立所有材料的數據矩陣。使用DataFor-mater 2.7軟件對所建矩陣進行數據轉換，利用POPGENE 1.31軟件計算觀測等位基因數（N_a）、有效等位基因數（N_e）、Shannon多態性指數（I）和Nei遺傳多樣性指數（H），采用PIC_CALC 0.6軟件計算各標記的多態信息量（ PlC）。

根據NTSYSpc 2.10軟件要求的格式將原始矩陣數據進行轉換，并通過該軟件計算出所有種質材料的遺傳相似系數，利用SHAN程序中的Tree plot繪制關于材料遺傳距離的UPGMA（算術平均非加權配組法）聚類樹狀圖。利用Origin2019b程序進行主成分分析（PCA）。

2結果與分析

2.1分子標記篩選分析

將所有標記在108份蘿卜種質中進行擴增，根據擴增結果挑選出帶型清晰、多態性好的分子標記56個。這56個標記在蘿卜基因組的每條染色體上都有分布，其中，8號染色體上的標記數最少，只有3個；5號染色體上最多，有11個標記（圖1）。

56個標記擴增出的條帶總數為130條，平均每個標記2.3條：PIC值在0.29～0.55之間，高于0.50的標記有3個，分別為RsIBP18、RsSSR109和RsIBP17：擴增出條帶最多的標記為RsSSR109，擴增出5條帶；43個標記（76.8%）只擴增出2條多態性條帶，分別有9個和3個標記擴增出3條和4條多態性條帶，只有1個標記擴增出5條多態性條帶（表2）。

通過POPGENE 1.31軟件分析，108份蘿卜材料的觀測等位基因數平均值為2.3214，有效等位基因數平均值為1.8643，有效等位基因的比例為80.31%，Nei遺傳多樣性指數平均值為0.4573，Shannon多態性指數平均值為0.6766（表3）。

2.2遺傳多樣性分析

基于上述篩選得到的56個標記，計算出108份蘿卜種質間的遺傳相似系數，遺傳距離的變化范圍為0.54～0.99，利用SHAN程序和UPGMA方法進行聚類分析，結果（圖2）顯示，在相似系數為0.61處，可將108份蘿卜種質分為4大類，第1類主要包括大、中型的綠蘿卜、白蘿卜和紅皮白肉的蘿卜材料，共94份；第2類包括6份綠皮紅肉的心里美類型種質材料：第3類僅為1份黑皮白肉的黑蘿卜；第4類則是小型的櫻桃蘿卜類型，包含7份材料。

進一步分析，在相似系數為0.677處可將第1類的94份材料分為8個亞類。A亞類包含材料最多，共有42份，約占供試材料總數的45%。在相似系數為0.71處，可進一步將A亞類分為2個組，第1組包括27份材料，均為綠蘿卜類型（ 21份為綠皮綠肉、5份為綠皮淡綠肉、1份為綠皮白肉），除來源于烏茲別克斯坦的1份材料根形為圓形外，其余材料肉質根均為長圓柱、圓柱或短圓柱形，均來源于國內，以山東為主：第2組的組成較為復雜，15份材料中有9份為紅皮白肉、5份為白蘿卜、1份為綠蘿卜，根形以圓柱和長圓柱形為主，來源地也比較分散。B亞類共9份材料，除1份白蘿卜來源于日本，其余均為國內的綠蘿卜種質，根形包括圓形、短圓柱、圓柱和長圓柱。C亞類的3份材料均為國內的綠蘿卜，根形圓柱或長圓柱形。D亞類為國內的紅皮白肉蘿卜，全部是圓形。E亞類是2份山東的紅皮白肉的圓蘿卜材料。F亞類的2份材料是國內的白蘿卜，肉質根圓柱形。G亞類除了1份淺紅皮白肉的國內種質，其余均為白蘿卜，來源于國內、韓國、日本和巴基斯坦，根形包括短圓柱、圓柱、長圓柱和細長圓柱形。H亞類是4份來自日本的細長圓柱形的白蘿卜材料。

利用Origin 2019b對108份種質進行主成分分析，結果（圖3）與UPGMA聚類分析結果基本一致，PC1、PC2和PC3所能解釋的遺傳變異分別為11.0%、9.3%和6.0%。值得注意的是，第1類中紅皮白肉的圓形種質昆紅19與其他種質距離較遠，第2類中QY-3和QX-123這兩份圓柱形的心里美種質與同類群的圓形心里美種質距離較遠。

3討論

了解種質的遺傳多樣性及其親緣關系有利于更好地對其進行評價鑒定，并可為育種研究提供數據支持。相較于形態標記和同工酶標記等分析方法，分子標記具有操作簡便、周期短、準確度更高等優點。已有研究發現，不同類型的分子標記在分析種質遺傳距離時存在一定差異，采用多種標記綜合分析可以使結果更加準確、可靠。本研究以分布在9條染色體上的118個分子標記在108份蘿卜種質中進行篩選，得到56個多態性好的標記，包括39個InDel標記、11個SSR標記和6個IBP標記，PIC值在0.29～0.55之間，屬于中高度多態性標記，符合篩選高質量分子標記的條件。這些標記在每條染色體上都有分布，以5號染色體上最多（11個），8號染色體上最少（3個），這與每條染色體上開發出的標記數量有很大關系。進一步分析結果表明，這些標記的觀測等位基因數平均為2.3214，有效等位基因數平均為1. 8643，有效等位基因的比例為80.31%，與之前報道的利用ISSR和SSR標記分析的結果相似：Nei基因多樣性指數的平均值為0.4573，Shannon多態性指數的平均值為0.6766，反映出本研究供試蘿卜種質材料具有較高的遺傳多樣性。

在種質分類方面，形態標記與分子標記具有一定的一致性。本研究供試的108份蘿卜種質被分為4類，第1類主要是綠蘿卜、白蘿卜、紅皮蘿卜，第2類是心里美蘿卜，第3類是黑蘿卜，第4類是紅皮和白皮的櫻桃蘿卜。心里美材料、黑蘿卜材料和櫻桃蘿卜材料各自聚為一類，說明這三種類型材料間親緣關系較遠。孔秋生等利用RAPD標記對56份種質的聚類分析結果也將1份心里美材料、1份黑蘿卜材料、8份櫻桃蘿卜材料各自聚為一類，與本研究結果一致。另外，本研究選用的108份材料中有6對雄性不育系及其保持系，聚類分析結果顯示，這6對材料中的01-11A/B、ZH-230A/B、TH-24A/B和KR-125A/B都與相同皮色、肉質色的材料聚類在一起，并且雄性不育系及其對應的保持系親緣關系最近；14青A/B和64A/B雖然沒有與大多皮色、肉質色相同的材料聚在一起，但其不育系及保持系之間的親緣關系也是最近的。這也證明了本研究結果的可靠性。

關于決定蘿卜種質親緣關系的關鍵因素，已有研究得到的結論并不完全一致，如Pradhan等利用RAPD標記分析發現，與按照地理起源進行分類相比，按照表型對蘿卜進行分類更可靠：孔秋生等通過AFLP標記分析發現，蘿卜肉質根的根皮色是我國國內種質資源分類的重要參考因素；周娜等的研究則表明，與種質資源親緣關系最密切的不是表型指標，而是材料的來源地，其次才是根肉色。在本研究中，前3類是大中型蘿卜種質，其分類與肉質根皮色、肉質色關系密切，第1類中的8個亞類也主要是皮色、肉質色相同的種質聚類較近：進一步分析第1類的8個亞類可以發現，在確定皮色、肉質色的前提下，種質聚類也與根形有一定的聯系。A亞類和C亞類的綠皮綠肉種質主要是長圓柱和圓柱形，B亞類主要是圓柱、短圓柱和圓形；A亞類中的紅皮白肉種質主要是長圓柱、圓柱和短圓柱形，在D和E亞類中的則全部是圓形；F亞類中的2份白皮白肉蘿卜是圓柱形，G亞類中的白籮卜主要是長圓柱形，H亞類中的是4份細長圓柱形種質。此外，第2類的6份心里美種質也是按圓柱形和圓形分別聚在了一起。前人研究中也有類似報道，即扁圓形和長圓柱形的白皮白肉種質分別聚類。但將本研究所用種質的來源地與聚類結果進行聯系，并沒有發現明顯的規律。對中、日、韓三個白蘿卜主產國的種質分析發現，韓國種質全部聚在第1類的G亞類，日本種質全部在G亞類和H亞類，而中國的白蘿卜種質在A、B、F、G四個亞類中都有分布，這在一定程度上反映了我國的種質資源更為豐富。Kobayashi等的研究表明，韓國種質均與中國種質聚在一起，日本種質雖與中、韓種質有所重疊，但差異較大，這與本研究結果有一定的一致性。

4結論

綜合本研究結果，蘿卜種質親緣關系與肉質根皮色、肉質色的聯系較密切，其次為根形。基于形態標記的分類雖與分子標記分類具有較高的關聯性，但由于受主觀判斷、生長環境等因素影響，分類結果并不完全一致。因此，在實際育種工作中，育種者要想快速、準確地評價種質材料以充分利用雜種優勢配置組合，應當在豐富的育種經驗基礎上適當采用分子標記進行輔助分析。