天津水稻穗腐病病原菌鑒定及室內毒力測定

姚玉榮　霍建飛　貴海燕　郝永娟　楊秀榮　孫淑琴　王萬立

關鍵詞：水稻穗腐?。悍蛛x鑒定：稻黑孢霉：毒力測定

中圖分類號：S435.11 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）03-0148-05

近些年，天津市大力發(fā)展小站稻的種植，天津市農委編制出臺了《天津小站稻振興規(guī)劃方案》，提出到2020年天津市小站稻種植面積穩(wěn)定在5.33萬公頃，2022年達到6.67萬公頃。隨著水稻種植面積的增大，病害發(fā)生種類和危害程度日益嚴重，水稻穗腐病對水稻產量和品質有較大影響，主要癥狀為在水稻潁殼上形成褐色斑點。該病在我國主要稻區(qū)均有發(fā)生。黃世文等報道的引起杭州水稻穗腐病病原菌主要為細交鏈格孢菌（Alternaria tenuis）、層出鐮刀菌（Fusarium， prolif-eratum，）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）及澳大利亞平臍孺孢菌（Bipolaris australiensis）。費丹等報道安徽省水稻穗腐病的病原菌主要有層出鐮刀菌（F.proliferatum）、細交鏈格孢菌（A.tenuis）、新月彎孢菌（C.lunata）、稻黑孢霉（Nigrosporaoryzae）。胡頌平等研究發(fā)現(xiàn)引起江西地區(qū)水稻穗腐病的主要病原菌為厚垣鐮刀菌（F.chlamydosporum）和細極鏈格孢（A.tenuissima），香茅彎孢菌（C.cymbopogonis）和稻黑孢霉（N.oryzae）兩種病原菌也有發(fā)生，且病原菌種類分布具有明顯的區(qū)域性。馬盾等報道了新疆水稻穗腐病病原菌主要為層出鐮刀菌（F.prolifera-tum），其次為新月彎孢菌（C.lunata）和細交鏈格孢菌（A.tenuis）；在水稻抽穗前5～7天采用50%咪鮮·稻瘟靈可濕性粉劑稀釋1500倍液、25%咪酰胺乳油稀釋1600倍進行噴霧，能夠有效預防該病害的發(fā)生。2016—2018年陳利軍等明確了河南信陽水稻穗腐病的病原菌種類主要為鐮孢菌（Fusarium， spp.）、細極鏈格孢（A.tenuissi-ma）、球黑孢菌（N.sphaerica）、稻黑孢霉（N.oryzae）、棒彎孢（C.clavata）、新月彎孢（C.luna-ta）、稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）和草酸青霉（Penicillium， oxalicum）。由于不同地區(qū)水稻穗腐病病原菌不同，使得該病害防治十分困難。

本研究對天津水稻主產區(qū)穗腐病病原菌進行分離，采用形態(tài)學和分子生物學方法對其進行鑒定，并對病原菌的藥劑敏感性進行測定，以期為研究該病原菌的致病機理、病害流行規(guī)律奠定基礎，并為該病害的科學防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

2020、2021年連續(xù)兩年對天津市寶坻區(qū)八門城村水稻種植田水稻穗腐病病樣進行采集，田間癥狀表現(xiàn)為水稻潁殼出現(xiàn)褐色斑點，發(fā)病嚴重時谷粒干癟、結實率降低、稻米畸形。

1.2病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法：將新鮮、發(fā)病的水稻穗沖洗干凈，剪取穗潁殼上病健交界處5 mm節(jié)段，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干水分后用鑷子置于含有0.1 g/L氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)平板上，放人28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4d，待長出菌絲后進行單孢純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌分子鑒定

將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集菌絲用CTAB法提取總DNA。用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4（ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Es Taq Master Mix（ Dye）25μL，上下游引物各2μL，DNA模板2μL，ddH₂O19μL。擴增程序：94℃4 min;94℃ 30 s，58℃30s，72℃ 50 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天津金唯智生物科技有限公司測序。測序結果進行同源性分析。

1.4病原菌室內毒力測定

供試藥劑：95.2%苯醚甲環(huán)唑，寧波三江益農化學有限公司：97%戊唑醇，江蘇劍牌農藥化工有限公司：95.3%丙環(huán)唑，天津市華宇農藥有限公司；95.1%嘧菌酯，利民化工股份有限公司；98%吡唑醚菌酯，陜西美邦農藥有限公司；95%咯菌腈，北京燕化永樂農藥有限公司：93.4%噻呋酰胺，吉林省八達農藥有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑，先正達（蘇州）作物保護有限公司；75%三環(huán)唑可濕性粉劑，江蘇耘農化工有限公司。

病原菌室內毒力測定采用菌絲生長速率法。配制系列梯度濃度（100、10、1、0.1μg/mL）的含藥PDA平板，以等體積無菌水為對照。將直徑5mm的病原菌菌餅接種到上述平板上，每處理3個重復，恒溫25℃培養(yǎng)4d。采用十字交叉法測定菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率（%）=（空白對照菌落直徑－藥劑處理菌落直徑）／（空白對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.5數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算不同藥劑的毒力回歸方程、相關系數(shù)、抑制中濃度（EC₅₀值）等。采用MEGA 5.0軟件對真菌ITS序列進行遺傳分析。

2結果與分析

2.1水稻穗腐病病原菌形態(tài)特征

連續(xù)兩年病原菌分離結果一致。如圖1所示，分離病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落疏松呈白色，放射狀擴展，后期呈墨綠、灰黑色，最后為黑色。菌絲分隔明顯；分生孢子頂生在一個透明的瓶狀細胞上，近球形，后期呈黑色，大小為（22.7～30.28）μm×（18.2～25.3）μm。

2.2水稻穗腐病病原菌分子鑒定結果

通過對測序結果進行BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)，分離菌株SDSF與稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）的同源性達100%（圖2），結合菌株形態(tài)特征，將菌株鑒定為N.oryzae。

2.3水稻穗腐病的抗性

2020年和2021年兩年稻黑孢霉菌株藥劑敏感性測定結果（表1）顯示，9種殺菌劑中，95%咯菌腈、95.3%丙環(huán)唑對對稻黑孢霉抑菌效果最好，2020年ECso值分別為0.2776、1.3102μg/mL，2021年ECso值分別為0.5171、2.0188μg/mL；98%吡唑醚菌酯、93.4%噻呋酰胺對稻黑孢霉抑菌效果較好，且兩個藥劑抑菌效果相當；80%代森錳鋅可濕性粉劑抑菌效果差異較大，2020年EC₅₀值為8.0151μg/mL，2021年EC₅₀值為24.6704μg/mL；95.2%苯醚甲環(huán)唑、97%戊唑醇及95.1%嘧菌酯對稻黑孢霉的抑菌效果均較差；75%三環(huán)唑可濕性粉劑對稻黑孢霉無抑制作用。

3討論與結論

本研究首次確定引起天津水稻主產區(qū)穗腐病的病原菌為稻黑孢霉（N.oryzae），與臺蓮梅、胡頌平、費丹等報道的稻黑孢霉是引起黑龍江、江西、安徽水稻穗腐病的主要病原菌之一結果相一致，今后在生產中應加強稻黑孢霉的監(jiān)控和防治。除水稻穗腐病外，稻黑孢霉（N.oryzae）還會引起葉斑病、穗梗腐病、鞘枯病。

本試驗中的苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、丙環(huán)唑、三環(huán)唑均為三唑類殺菌劑，能夠抑制孢子萌發(fā)和附著孢形成，阻止病菌侵入和減少孢子的產生。稻黑孢霉對丙環(huán)唑的敏感性較高，EC₅₀值分別為1.3102μg/mL和2.0188μg/mL；其次為苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇，兩個藥劑的抑菌效果相當；由于生產中水稻稻瘟病的防治藥劑主要為三環(huán)唑，導致該病原菌抗性強，不適宜作為稻黑孢霉引起的水稻穗腐病防治的候選藥劑。嘧菌酯和吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，作用機理主要是通過阻止細胞色素間的電子傳遞，阻止三磷酸腺苷的形成，從而抑制線粒體的呼吸，達到殺菌的作用。本試驗中吡唑醚菌酯對稻黑孢霉的抑菌效果好于嘧菌酯，這可能與生產中藥劑使用頻率相關?？┚鏋楸交量╊悮⒕鷦饕ㄟ^抑制病原菌葡萄糖磷?；霓D移，抑制病原菌的正常生長和代謝，導致病菌死亡：同時還能阻礙蛋白質與核酸的合成及細胞正常生物氧化過程，該藥劑對稻黑孢霉抑菌效果顯著，EC₅₀值<1μg/mL，生產中推薦使用。噻呋酰胺是新型的噻唑酰胺類殺菌劑，通過抑制病原真菌三羥酸循環(huán)中的琥鉑酸脫氫酶，抑制病原菌的正常生長。代森錳鋅可濕性粉劑為一種廣譜保護性殺菌劑，作用機理為抑制病原菌細胞內丙酮酸氧化。噻呋酰胺與代森錳鋅可濕性粉劑對稻黑孢霉抑菌效果相當。馮愛卿等測定了10種殺菌劑對稻黑孢霉的敏感性，其中10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯乳油及50%咯菌腈可濕性粉劑對稻黑孢霉菌的抑制效果最好。李戌清等研究發(fā)現(xiàn)75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、325g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑、250g/L嘧菌酯懸浮劑對稻黑孢霉菌菌絲生長有較好的抑制作用。

綜上，咯菌腈和丙環(huán)唑對稻黑孢霉抑菌效果最好，其次為吡唑醚菌酯和噻呋酰胺，該4種殺菌劑均可作為生產中防治稻黑孢霉的候選藥劑。80%代森錳鋅可濕性粉劑兩年的抑菌效果差異較大。苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇及嘧菌酯由于在生產中使用較為頻繁，效果略差；75%三環(huán)唑對稻黑孢霉無抑制作用。本試驗為天津地區(qū)由稻黑孢霉引起的水稻穗腐病的防治提供了一定的科學依據(jù)。