例談基于PCR的基因定點突變技術

朱棟棟

近年來，各地多次考查重疊延伸PCR、大引物PCR等新型PCR技術，但不少一線教師對其理解不夠透徹。除此之外，重組PCR、環狀質粒PCR等也能對基因進行定點誘變，其原理不完全相同，使用情境也各有側重。本文以基因定點突變技術為線索，將相關的幾種PCR技術串聯在一起，幫助一線教師拓展視野，并提供教學素材。

1 基因定點突變技術的研究意義

人類很早就意識到基因突變、基因重組等可遺傳變異對進化的重要作用，但是傳統的基因突變和基因重組具有不定向性，極大地延長了基因向人類需求進化的時間。轉基因技術和基因定點突變技術能夠分別實現基因定向重組和基因定向突變。同時，由于當前科學界尚未建立能精確預測特定氨基酸殘基變化對整個蛋白質結構及活性影響的模型，對氨基酸定點突變存在一定的盲目性，所以基因定點突變是目前科學家進一步了解蛋白質結構與功能的重要手段。

2 基于PCR的基因突變技術

基因突變容易發生于DNA的復制期間。早在20世紀70年代，就有科學家通過誘變引物建立了體外寡核苷酸介導的 DNA 突變技術。隨著 PCR 技術的興起，基因突變技術得以豐富和發展。目前，基于PCR的基因突變技術主要有兩種思路：第一種是利用TaqDNA聚合酶的缺陷，通過限制某種脫氧核苷酸的含量而引起錯誤配對。第二種是在引物的5端引入突變堿基，或者增加或減少一個或多個堿基，通過PCR大量擴增突變DNA。兩種思路相比較而言，第二種能更為準確地實現基因的定點突變，故下文主要討論第二種思路。

3 基于PCR的基因定點突變技術

3.1 重疊延伸PCR

重疊延伸PCR需要設計兩對引物：上游引物a、突變引物b以及下游引物d、突變引物c。其中突變引物b和c加入了突變堿基，且具有重疊區域，如圖1所示，引物中突變堿基處用“·”表示。第一、二輪PCR時（即圖1中PCR1和PCR2）分別用引物a、b和引物c、d在兩個PCR體系中擴增出突變堿基上游片段AB和下游片段CD。此時，AB和CD都攜帶突變堿基，但不具有完整的DNA長度。由于這兩個片段具有重疊區域，將其置于一起時能局部配對并延伸，再通過上游引物a和下游引物d進行PCR可以擴增出大量含有突變堿基的DNA，即AD。

與單突變引物法相比，重疊延伸PCR能將突變堿基加入至DNA的內部。但是這種方法往往需要三輪PCR才能獲得產物，過程繁瑣。有學生提出如下解決方案：在上述設計基礎上做出改進，將突變堿基置于兩種突變引物（即b和c）的5端的第一個堿基位置，如此突變引物b和c就不必重疊，則可以在一個試管中同時完成兩輪 PCR 反應，再用引物 a 和 d 大量擴增。經思考討論后學生發現該方案不可行：該方法得到的上游片段AB和下游片段CD重疊區域僅有一個突變堿基，重疊延伸階段無法穩定有效的復性，所以突變引物攜帶的錯配堿基應位于中央位置。

3.2 大引物PCR

由于重疊延伸PCR需要三輪PCR才能獲得大量突變DNA，多輪PCR因引物的改變要將PCR產物進行試管的轉移，而這種轉移容易造成樣品遭受環境污染。有學者巧妙地設計出只需要兩輪PCR即可獲得突變DNA的方法，即大引物PCR法。

在大引物PCR反應體系中，先加入上游引物和突變引物（圖2），以擴增出含有突變堿基的部分DNA片段，然后以此DNA片段的一條鏈作為大引物，配合下游引物擴增出含有突變堿基的完整DNA。

大引物PCR的巧妙之處在于摒棄了在突變堿基上下游分段、分別PCR的思路，將第一輪PCR出的產物作為第二輪PCR的引物，直接獲得了突變DNA。但是這種方法依舊存在試管轉移的問題。有學者提出，可以將第二輪PCR中下游引物長度設計地比第一輪上游引物長一些，這樣就可以通過適當提高退火溫度以抑制上游引物在第二輪中與模板鏈的結合。筆者在繪制圖2時還產生了一個疑問： “突變引物應更接近近端側還是遠端側？”經過思考不難得出，因為第一輪擴增產物作為第二輪PCR的大引物，根據引物不宜太長原則，所以應該接近近端側。

3.3 重組PCR

對于環狀DNA，尤其是質粒而言，重組PCR不失為一個可行的基因定點突變的方法。其基本思路如下：先用限制性核酸內切酶將質粒模板切成線性DNA（即線性化）。在一個PCR體系中用引物1和含突變堿基的引物2擴增出帶突變堿基的DNA片段，在另一PCR體系中以與引物1、2互補的引物3和4擴增出另一種帶突變堿基的DNA片段。因為兩個PCR體系中選擇的引物互補，擴增出來的兩種DNA的兩端具有同源序列，將其導入大腸桿菌體內會發生同源重組，形成含突變堿基的環化質粒。

這種技術巧妙地通過引物設計擴增出具有同源序列的1/2線性化質粒模板DNA，通過共轉化、同源重組，形成含突變堿基的突變質粒。為什么要將質粒模板線性化后再分別PCR呢？理論上環狀DNA可以直接PCR，但實踐表明這種方式得到的PCR產物中含有較多擴增出來的質粒模板，需要純化。而且直接以環狀DNA為模板擴增，需要更多次數的循環。這是因為與線性DNA模板相比，直接以環狀DNA為模板擴增的效率更低。

3.4 環狀質粒PCR

科學研究發現，利用寡核苷酸介導的DNA突變會產生大量非突變DNA，主要原因是部分質粒會逃避突變。于是學者們開發出體外選擇性破壞非突變DNA的方法，如Dpn Ⅰ酶切法。Dpn Ⅰ是一種限制性核酸內切酶，它能識別并酶切DNA雙鏈中腺嘌呤N6位甲基化（N6-methyladenine）的GATC序列。Dpn Ⅰ識別位點中兩個腺嘌呤的N6位都甲基化時，呈現正常的酶活力，只有一個腺嘌呤的N6位甲基化時，酶切活力會降低約60倍。從大腸桿菌中分離的質粒已在內源性Dam甲基化酶的作用下被完全甲基化了，少數Dam缺陷型大腸桿菌可用Dam甲基化酶進行體外甲基化，而PCR合成的DNA沒有甲基化。

如圖4 所示，在 PCR 體系中加入含突變堿基的引物和正常引物，擴增出的 DNA 包括：一條鏈含突變堿基的 DNA（產物 1）、兩條鏈均含突變堿基的DNA（產物2）、兩條鏈均不含突變堿基的DNA（產物3）。利用Dpn Ⅰ選擇性地切斷兩條鏈均不含突變堿基的DNA和一條鏈含突變堿基的DNA，利用Dpn Ⅰ也可切除這種 DNA 中未甲基化的母鏈，但效率較低，所以處理時間應相應延長，且斷裂的 DNA 不穩定，很容易被水解。最后將兩條鏈均含突變堿基的DNA導入感受態的大腸桿菌中，大腸桿菌會將其環化并大量復制。

當然，該方法存在因正常引物擴增出大量不含突變堿基的DNA，而且Dpn Ⅰ切除不徹底，導致獲得的突變DNA陽性率低的問題。據此有研究人員提出用含突變堿基的單引物進行PCR，即單引物PCR法。主要思路如下（圖5）：先用含突變堿基的單一引物對質粒模板進行不對稱PCR，經過一輪擴增獲得了一條鏈含有突變堿基的雙鏈DNA（產物1）和一條置換出來的親代單鏈DNA（產物2）。在第二輪循環中，含突變堿基的單一引物只能和上述三條鏈中的一條鏈（即第一輪的模板鏈）配對。如此循環下去，獲得了較多的含突變堿基的單鏈DNA（產物3）。然后加入Dpn Ⅰ短時間處理，破壞甲基化的母鏈。最后轉化感受態大腸桿菌，在其體內完成雙鏈復制并環化（產物4）。

單引物PCR法陽性率高，足以獲得帶有目的突變的DNA。但需要注意的是，該方法對突變DNA鏈進行線性擴增，擴增效率較低。目標DNA鏈到達一定的量后可以將其導入大腸桿菌體內進行指數擴增，以獲得大量突變DNA。

4 小結

以PCR為基礎的突變方法優點很多，如突變效率高、可以任意定點誘變、快速簡單等。如果對需要改造蛋白質結構功能信息很明確，就可以用上述方法設計一系列突變體，通過重疊延伸PCR、大引物PCR、重組PCR和環狀質粒PCR等方法構建出定向突變體。

另外，構建融合蛋白時，也可以采用重疊延伸PCR和重組PCR等方法。

參考文獻：

［1］ 朱玉賢.現代分子生物學［M］.北京：高等教育出版社，2019：208.

［2］ 黃留玉.PCR最新技術原理、方法及應用［M］.北京：化學工業出版社，2010：82.

［3］ 彭向雷，王燁等.單引物PCR法引入定點突變［J］.中國生物工程雜志，2020 （08）：19-23.