陸地棉種質黃萎病抗性生理鑒定分析

程利華,楊紅蘭, 馬清倩, 史 瑩,張大偉,Alisher A. Abdullaev,張道遠

(1.新疆農業大學農學院/棉花教育部工程研究中心,烏魯木齊 830052;2.新疆抗逆植物基因資源保育與利用重點實驗室/中國科學院新疆生態與地理研究所,烏魯木齊 830011;3.石河子大學生命科學學院,新疆石河子 832003;4.新疆農業科學院經濟作物研究所,烏魯木齊 830091;5. Center for Advanced Technologies under Ministry of Innovative Development of Uzbekistan,Uzbekistan 100174)

0 引 言

【研究意義】20世紀90年代初棉花黃萎病爆發,發病面積達266.67×104hm2[1、2]。2002年全國統計棉花黃萎病發病面積300×104hm2[3]。2009年我國黃萎病發病面積約占植棉總面積的50%,每年損失皮棉7.5×104～10×104t[4]。目前尚未有防治棉花黃萎病的特效藥劑,選育和利用抗病品種是控制該病害最為經濟有效的手段[5]。【前人研究進展】枯黃萎病混生病圃連續多年的定向選擇,培育出棉花抗黃萎病育種的優良種質材料冀616和冀171等[6]。通過病圃連續選擇雜種世代材料,育成的陜棉抗病種質對棉花枯、黃萎病具有較高的抗性[7]。近年來在棉花黃萎病發病機理及抗性獲得機制上也有研究[8-11]。植物體通過水解酶等酶類破壞病菌的侵染結構從而獲得抗性,通過抗菌蛋白GAFP、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶、Hcm1、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)等[12-16];病菌促使植物體產生大量的ROS(活性氧物質)信號協助侵染[9],植物通過氧化還原酶清除多余ROS,降低細胞膜脂的過氧化作用,減少細胞膜的損傷,和保障細胞正常的生理功能,迫使病菌定殖失敗而獲得抗性,還原酶包括過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、NADPH氧化酶RBOH、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多胺氧化酶PAO等[17-21];通過木質素的機械屏障阻礙病菌入侵[15、16];通過脯氨酸(PRO)滲透調節物質保障細胞的抗性能力[22]。【本研究切入點】目前存在黃萎病遺傳資源狹窄的問題,需引進黃萎病抗性種質,鑒定棉花品種及其種質資源的抗病性,擴充黃萎病抗性棉花種質資源儲備。【擬解決的關鍵問題】以10份國外棉花種質(Gossypiumhirsutum)為材料,室內盆栽棉花接種大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb),研究其形態及生理層,分析棉花品種抗性與棉花黃萎病發生的關系,篩選優質黃萎病抗性品種,為進一步品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

10份陸地棉棉花材料和大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.菌株編號為V991)均由新疆抗逆植物基因資源保育與利用重點實驗室提供。表1

1.2 方 法

1.2.1 室內盆栽

棉種催芽:棉種先用濃硫酸脫絨,用清水洗凈;其次選擇籽粒飽滿、成熟的種子泡在無菌水中,放置在30℃恒溫培養箱中過夜。

基質裝盒:按此比例(南山黑土∶草炭土∶蛭石∶珍珠巖=5∶3∶1∶1)配制基質,高壓滅菌121℃,25 min;用水濕潤基質,使基質含水量達到自身重量的60%為宜(即將基質手捏成團,手指間不見流水,落地后自然散開)。再將濕潤的基質裝入小方盒中,小方盒稍做抖動,用手指將盒中基質輕輕壓實,盒中基質表面離盒面1.0～1.5 cm;每18盒裝入1個蓄水盤中。

棉苗播種:選擇露白的種子播種,每盒播5粒(四角和中心各1粒),根尖朝下,輕輕插入基質中。每個材料6盒,播種完后用基質進行覆蓋,基質與小方盒面相平;每周根灌水2～3次。

1.2.2 大田種植

10份棉花材料于2019年在新疆瑪納斯棉花基地試驗田栽種,田間日常管理按常規管理進行,統計其發病率與發病指數。

1.2.3 大麗輪枝菌菌液準備

將4℃冷藏保存的V991轉移至固體的察氏培養基中,于25℃培養箱培養7 d,切下0.5 cm2大小的菌塊接種于液體的察氏培養基中,使用500 mL三角瓶,裝入200 mL察氏培養基和適量玻璃珠進行搖菌。25℃振蕩(120 r/min)培養3 d左右,用3層紗布過濾后,用血球計數板估算孢子數量,用無菌水稀釋至菌體濃度為107CFU/mL,備用[23]。

1.2.4 接菌處理

選擇下午19:00左右接菌處理,按照王省芬等[24]六棱塑料缽定量注菌液法做簡單修改后進行接菌處理,棉花接菌時期在2～3真葉期,每個供試株系挑選長勢一致的放入一個蓄水盤中,每個小方盒四周均用小木棍插入底部進行傷根處理,每一個小方盒中加50 mL菌懸液,從小木棍插入口的輕柔緩慢的導入基質中,靜置過夜,2 d后開始正常澆灌。

1.2.5 表型及病情

棉苗接菌14 d時進行表型拍照和病情統計,所得圖片采用Photoshop軟件處理;植株發病等級共分為5級:0級,健康,無癥狀;1級,發黃或枯萎葉片小于25%;2級,發黃或枯萎葉片為25%～50%;3級,發黃或枯萎葉片為50%～75%;4級,發黃枯萎葉片大于75%[25]。計算發病率和發病指數[26]。

病情指數=

1.2.6 生理指標

棉苗用于生理指標測定的樣品收集時間分別為接菌0、14 d;收集的棉苗的頂葉(同一部位),所有樣品均用錫箔紙包裹,做好標記,液氮冷激,放置超低溫(-80℃)冰箱中保存備用。所得樣品的生理指標(H2O2、MDA、PAL、PRO及木質素)均用南京建成生物技術有限公司的相應試劑盒測定;數據均由3次重復的平均值和標準誤組成,采用Duncan法對數據進行多組樣本間差異顯著性分析。

1.2.7 DNA的提取

用于提取總DNA的棉苗樣品收集時間分別為接菌0、14 d;收集的所有樣品均用錫箔紙包裹,做好標記,液氮冷激后,放置超低溫(-80℃)冰箱中保存備用。棉花總DNA提取采用試劑盒中植物組織磁珠法,該試劑盒購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.8 實時熒光定量PCR定量分析

標曲制定:以大麗輪枝菌為模板,采用大麗輪枝菌特異引物(VDIGS-F:5'-CGAATAGGCACACTCAGATTACCC-3';VDIGS-R:5'-TCGCCACAACCTCGATTCCAC-3'),PCR擴增獲得特異條帶,克隆至T載體,測序鑒定序列可靠性。提取測序正確的克隆菌株中的質粒,檢測質粒濃度后稀釋10-1～10-8倍,取2 μL為模板,定量PCR制定標曲。

用熒光定量PCR儀測定棉苗葉片中菌體總DNA含量,稀釋至同一濃度(20 ng/μL),取出2 μL為模板,加入0.5 μL大麗輪枝菌特異引物,以及定量PCR預混液(Takara,大連),總體積為20 μL。以標曲為參照,定量分析PCR。表2

表2 實時熒光定量PCR體系

在冰上配制上述體系并混勻,進行Real time PCR反應。

實時熒光定量PCR反應程序為:95℃預變性30;95℃變性5,60℃退火30,40個循環;65℃ 5熒光檢測;65～95℃,0.5℃(0.05)溶解曲線熒光檢測,以獲取溶解曲線。

1.3 數據處理

運用Excel 2010進行數據整理,采用 SPSS 19.0軟件進行方差、相關性和主成分及聚類分析;采用SigmaPlot 12.5軟件進行作圖。

將數據進行同趨勢化處理,進行正向化處理,例如,將X進行1/X變換[27]。不同棉花品種各綜合指標的隸屬函數值μ(Xj)的計算見公式(1);各綜合指標的權重系數Wj的計算見公式(2);各棉花品種抗性的綜合評價(D)的計算見公式(3)。應用主成分分析法結合隸屬函數進行綜合分析。綜合指數值D越大,黃萎病抗性越好。

(1)

(2)

(3)

式中,Xj表示第j個綜合指標;Xmin表示第j個綜合指標的最小值;Xmax表示第j個綜合指標的最大值。Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權重;Pj為各棉花品種第j個綜合指標的貢獻率。D值為各棉花品種由綜合指標評價所得的黃萎病抗性綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 大麗輪枝菌脅迫下棉花表型動態變化

研究表明,不同株系的棉花出現明顯的黃萎病癥狀。在接菌后14 d左右,其中A-1139、04219和05189品種(系)發病情況較重(發病率> 90%), 05160、04219和A-924次之,其他品種(系)發病情況較輕。圖1

03804、05160、A-6 3個品種病情指數在30～50;其次是A-91、04841、04219、05189和A-688病指在50～70;最后是A-1139和A-924病指達到70以上。03804、05160和A-6病指在20左右,A-91、04219、05189和A-688,病指在25～50,04841、A-1139和A-924病指在50以上。圖2

圖1 棉苗在大麗輪枝菌(菌液107 個/mL)接菌后0、14 d的表型動態

注:(a)室內棉苗接大麗輪枝菌14 d病情指數,(b)大田病情指數;CK:對照組,T:處理組;不同字母(a,b…)代表各種質組間在0.05水平上差異顯著,P<0．05,下同

2.2 棉花葉片含菌量qPCR變化

研究表明,棉花各材料之間存在顯著差異。03804、A-6、A-91、A-924含菌量相對較低;其次是A-1139、05189、04841,最后是A-688、05160和04219,三者含菌量較高。圖3

2.3 大麗輪枝菌對棉苗生理生化指標的影響

研究表明,10份材料在接種病原菌后,與CK相比其H2O2、MDA、PAL和PRO含量均顯著上升;而木質素含量不存在顯著差異。

各種質之間H2O2存在顯著差異,其中05189 材料含量最高,達到1 337 μmol/g ;而03804明顯低于其他種質。與CK相比,05160、04841、A-924、A-91、05189、04219、A-1139、A-6及A-688 的H2O2含量呈顯著差異,其中05189 材料H2O2變化量也最大,高達8倍。

各種質之間MDA存在顯著差異,其中A-924材料含量最高,達到69 nmol/g;與對照相比,05189和A-924的丙二醛含量呈顯著差異,05189材料的MDA變化量最大,高達4倍。

各種質之間PAL存在顯著差異,05189 材料含量最高,達到38 U/g。經黃萎病脅迫后,與CK相比,苯丙氨酸解氨酶活性呈上升趨勢,05160、04841、A-924、A-91、05189、04219、A-1139、A-6及A-688的苯丙氨酸解氨酶活性呈顯著差異,其中A-688材料的PAL變化量最大,高達6倍。

注: (a) 接大麗輪枝菌菌液14d葉片含菌量qPCR分析 (b)qPCR標曲

各種質之間PRO存在顯著差異,A-924 材料含量最高,達到135 μg/g;經黃萎病脅迫后,棉花葉片中的脯氨酸呈上升趨勢,與CK相比,03804、04841、A-924、A-91、04219、A-1139、A-6及A-688的脯氨酸含量呈顯著差異。其中A-688材料的PRO變化量最大,達到8倍。

03804材料木質素含量最高,是其他材料的1-3倍。經黃萎病脅迫后,與CK相比,棉花葉片中的木質素含量無明顯變化,各品種(系)之間不存在顯著差異。圖4

2.4 棉花黃萎病抗性指標的相關系數矩陣

研究表明,當棉花受到大麗輪枝菌侵染后,丙二醛、過氧化氫、苯丙氨酸解氨酶以及發病率四者相互呈顯著正相關;木質素與過氧化氫、發病率呈顯著負相關。表3

2.5 棉花黃萎病各綜合指標、生理指標主成分

研究表明,得到了5個新的相互獨立的綜合指標和貢獻率。選擇兩個主成分,得到棉花各生理指標的主成分系數,即PC1、PC2,貢獻率分別為64.951%,20.386%,兩者累計貢獻率達到85.337%。表4,表5

表3 棉花黃萎病抗性指標的相關系數矩陣

注:CK:對照組,T:處理組;‘*’‘ **’:分別表示種質組內P<0．05和P<0.01,下同

2.6 抗性綜合評價

研究表明,對于同一綜合指標,如Y1,03804的U(X)最大,為1,該品種在這一綜合指標上表現為抗性最強;而05189的U(X)最小,為0,該品種在這一綜合指標上表現為抗性最差。U(X1)、U(X2)的權重分別為0.761,0.239。

05189棉花樣品D值最小,在參試的10個不同品種棉花中其抗性最差;03804棉花品種D值最大,其黃萎病抗性最強。將這10份材料分成Ⅲ類:其中,03804為第I類,屬于抗性材料;A-688、A-91、A-924、A-6、05160屬于第Ⅱ類,為耐病材料;04841、05189、04219、A-1139為第Ⅲ類,屬于黃萎病敏感材料。該聚類結果與田間病指相符合。表6,圖5

表4 棉花黃萎病各綜合指標的特征值、貢獻率及累計貢獻率

表5 棉花黃萎病抗性各生理指標的主成分矩陣

表6 棉花各品種黃萎病抗性的綜合指標值Y、權重、U(Xj)、D值及綜合評價

圖5 10份棉花種質資源黃萎病抗性聚類

3 討 論

3.1 室內與大田的病情指數差異

主成分分析可將原來多組單個指標組合成一組新的相互獨立的主成分單元,在損失較少原有信息的前提下,通過降維的方法濃縮數據和簡化指標,揭示變量間的關系[28]。影響棉花黃萎病發生的因素有棉花品種抗性水平、栽培措施、氣象因子、病原茵致病性及數量積累等[29]。棉花區試田間病情調查結果與人工病圃鑒定結果存在較大差異,不同的抽樣規模和抽樣方法對品種的抗病性評價有顯著影響[30]。采用沾根或傷根灌窩接菌,待發病達高峰時,田間病床早期鑒定與大田病圈的抗性一致,苗期黃姜病鑒定與花鈴期病情指數達極顯著相關,是棉花抗病育種早期杭性篩選和鑒定的有效方法[31]。研究中室內和田間的種植環境與數量都有著巨大差異,病情統計方法也有所不同,兩者的病情指數產生一定差異。兩者趨勢相同,室內植株的病情指數可以反映植株之間的抗性情況。室內指標綜合抗性排序結果與大田病指基本相符合,室內棉花黃萎病鑒定方法可靠。

3.2 棉花黃萎病抗性生理指標響應

當作物接種大麗輪枝菌后,可以觸發了許多短期和長期的防御機制,包括H2O2的產生、PAL的活性,PRO的積累以及苯丙素代謝和木質素的合成等各方面[22、32-37]。試驗中棉株接菌后MDA、PAL和木質素的變化,與侯麗娟等[38]的研究結果相相符即棉株接菌后MDA、PAL和木質素顯著增加。

H2O2是細胞過氧化的產物,指示細胞的活性氧(ROS)累積程度,細胞受到脅迫隨之增加[35]。MDA是膜脂過氧化的最終產物,會對細胞膜造成損傷,在病害脅迫下,植物體內膜脂過氧化作用增強,MDA含量增加[36]。研究中,兩者呈極顯著正相關,兩者均可以表示棉花葉片受傷害的程度,而木質素是作為物結構組成中重要的大分子,對機械支撐和水運輸至關重要,對害蟲和微生物起到一定防御作用,可提高作物的抗逆性[33、34]。研究中03804是所有材料中相對抗性最好的材料。可能是由于03804葉片中木質素含量較高,而其 H2O2、PAL和MDA與其他品種(系)相比較低。03804中木質素在一定程度上發揮了阻止病原菌侵入的作用。PAL與木質素的合成密切相關[39],木質素的合成來自苯丙氨酸,而PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶,與植物的抗病性有密切關系[37]。試驗中棉花葉片中的苯丙氨酸解氨酶顯著增加,棉苗接種黃萎病菌后,植物的防衛系統特別是苯丙烷類代謝被激活,PAL活性迅速上升。當作物受到生物脅迫或分生物脅迫時,都會導致植物體內脯氨酸的積累[40-42]。試驗中棉花葉片中的脯氨酸含量也呈顯著增加,棉花受到黃萎病菌脅迫時,體內會積累大量脯氨酸。脯氨酸除了作為植物細胞質內滲透調節物質外,還在穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調節細胞氧化還原等方面起重要作用[22]。脯氨酸的積累有可能提高作物的抗性。

根據降維后的綜合指標值的貢獻率求出其相應的隸屬函數值,并依據各綜合指標的貢獻率(權重)進行加權,得到各品種(系)抗病性的綜合評價值(D值)。由于D值是一個無量綱的數,從而使各品種的抗病性的差異具有可比性[43]。趙曉軍等[44]利用主成分分析法評價燕麥品種,可以簡潔明了地對試驗品種的優劣進行排序,并且可以摒棄不同度量指標因量綱不同帶來的差異,可以有效減少系統誤差,提高試驗的準確性。葛禮嬌等[45]利用主成分分析和隸屬函數分析確定篩選菊花苗期氮高效品種的最適供氮水平和評價指標,篩選菊花苗期氮高效品種南農麗黃、南農小金帽、南農豐收、南農旭日、南農廬月。試驗通過主成分分析和隸屬函數分析得到的結果具有一定的可靠性。

4 結 論

不同株系的棉花出現明顯的黃萎病癥狀,篩選出抗黃萎病較強的棉花種質資源。03804由于木質素含量高,降低細胞傷害,抵御病菌的入侵,降低發病率,為抗性棉花材料。A-688、A-91、A-924、A-6和05160五個品種(系)通過積累的脯氨酸,調節細胞質內滲透,降低傷害,屬于耐病材料;04841、05189、04219和A-1139產生大量過氧化氫與丙二醛,造成細胞膜嚴重受損,為敏感材料。