許氏平鮋源嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗

李惠

摘要：為了解青島地區人工養殖許氏平鮋（Sebastes schlegelii）病原菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的流行情況和耐藥性情況。對2020～2021年采集青島地區人工養殖場中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份，采用常規的細菌分離鑒定方法和PCR方法進行嗜水氣單胞菌分離鑒定，采用人工感染動物試驗和K-B藥敏紙片法分別檢測嗜水氣單胞菌分離菌株的致病性和耐藥性。結果顯示：從127份病料樣品中分離到68株嗜水氣單胞菌，分離率為53.5%（68/127），50株嗜水氣單胞菌可以引起許氏平鮋死亡為致病性菌株；50株許氏平鮋對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9種藥物耐藥率在52.0%以上，對其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。該研究為許氏平鮋源嗜水氣單胞菌合理用藥及防控提供了參考。

關鍵詞：許氏平鮋（Sebastes schlegelii）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；分離鑒定；致病性；藥敏試驗

中圖分類號：Q93；S965.399文獻標志碼：A

許氏平鮋（Sebastes schlegelii）又稱為黑魚、黑頭和黑鲪等，屬鮋形目（Scorpaeniformes）、鮋科（Sebastidae）、平鮋屬（Sebastes），主要分布于中國的渤海、黃海及東海地域，主要以網箱養殖模式進行飼養^[1]。許氏平鮋屬于冷水性肉食性魚類，富含多種營養物質且肉質鮮美、生長速度較快、抗病能力強，在中國北方沿海人工養殖廣泛且成為主要冷水性魚類養殖品種^[2-3]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila ，以下簡稱A.hydrophila）為臨床中常見的人-畜-水生動物共患的病原菌之一，該菌廣泛存在于自然界中土壤、水源及養殖環境中，且對大多數的哺乳動物、水生動物及人具有不同的致病性^[4]。A.hydrophila可以引起多種動物和人的敗血癥、肺炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的臨床癥狀，同時可以引起食物中毒，嚴重危害著動物和人的健康，對該病的防控具有重要的意義^[5]。A.hydrophila可以感染多種動物及野生動物（豬、牛、羊、鹿），尤其對魚類（多寶魚、半滑舌鰨魚、大黃魚、黃顙魚等）致病性較強，其感染率和死亡率均較高，成為魚類養殖過程中的常見的病原菌之一，嚴重危害魚養殖業的發展^[5-6]。近年來，關于A.hydrophila感染魚類的報道越來越多，臨床中以體表磷脫落出血、肛門脫垂及腸炎等癥狀為多見，其死亡率較高，給養魚業造成嚴重的經濟損失^[7]。國內外相關研究表明，A.hydrophila耐藥性已經普遍存在且呈現逐年增高的趨勢，給臨床用藥帶來一定困難，已成為公共衛生安全問題^[8]。該試驗對采集病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份進行嗜水氣單胞菌分離鑒定，并檢測其致病性和耐藥性，以期為該地區許氏平鮋源嗜水氣單胞菌合理用藥提供了參考。

1? 材料與方法

1.1 菌株來源

2020～2021年采集青島地區人工養殖場中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份，對采集的樣品進行處理并進行嗜水氣單胞菌的分離鑒定。

1.2 細菌分離與培養

將采集的樣品進行處理后，無菌的條件下接種于7%綿羊脫纖血液培養基進行增菌培養，30℃恒溫培養12hrs～18hrs后，挑取單個菌落接種于AHM選擇培養基上進行鑒別培養，37℃培養12hrs～18hrs，進行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態學。

1.3 生化試驗鑒定

參照VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡說明書，將分離菌株接種在營養肉湯中培養至對數期，調整菌液濃度為0.5個麥氏濁度，無菌的條件接種于紙質條中， 37℃培養12hrs～18hrs進行生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定

根據參考文獻^[9]設計細菌16SrRNA 基因通用引物，在上海生共合成引物（表1）。用水煮沸提取分離菌株的基因組并進行PCR鑒定。回收PCR產物回收送上海生共測序與比對。

1.5 致病性試驗

參考文獻^[7]的方法，將分離菌株接種于營養肉湯中培養至對數期調整菌液濃度為10⁷cfu/mL，每株分離菌株肌肉注射5尾500g左右許氏平鮋，劑量為0.25mL（10⁷cfu/mL），對照組給予等量的無菌生理鹽水。試驗期為7d并觀察許氏平鮋發病情況。

1.6 藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗法標準進行操作與結果判定。

2 結果

2.1 細菌分離培養

疑似A.hydrophila的菌株通過7%綿羊脫纖血液培養基、AHM選擇培養基上進行鑒別培養分離培養及鏡檢觀察其形態學結果，均符合A.hydrophila的培養特性和形態學。

2.2 細菌生化試驗

通過VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡進行生化鑒定，68株分離菌株初步鑒定為A.hydrophila。

2.3 細菌PCR鑒定

對初步鑒定為A.hydrophila用PCR進行進一步鑒定。結果顯示分離的68株分離菌株均擴增出大約為1500 bp的目條帶（圖1）。通過測序對比68株分離菌株與參考株（A.hydrophila）的同源性均大于98%，說明分離株為A.hydrophila，分離率為53.5%（68/127）。

2.4 致病性試驗

攻毒組許氏平鮋在攻毒后2d～3d出現了不同的發病情況，且個別攻毒的許氏平鮋不表現任何癥狀出現急性死亡，剖檢死亡的許氏平鮋后采集病料組織，分離得到A.hydrophila，攻毒試驗結束對照組許氏平鮋健康存活。經統計，50株A.hydrophila能引起許氏平鮋死亡為致病性菌株。

2.5 藥敏試驗

分離菌株的耐性分析顯示，50株致病性A.hydrophila對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素、氨芐西林、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、多西環素等9種藥物的耐藥率為52.0%～84.0%之間，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素5種藥物耐藥率為4.0%～30%；說明臨床中分離的50株致病性A.hydrophila對臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

A.hydrophila為臨床中常見的人-畜-水生動物共患的條件性致病菌，該菌廣泛存在于環境中及水環境中，該菌可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、黏膜創傷、消化系統感染）在不同水生動物之間傳播^[10]。A.hydrophila可以引起多種動物及野生動物感染，急性病例具有發病比較急、死亡率較迅速等特定，為魚類常見的急性、敗血性的一類疾病^[4-5]。近年來，關于魚類A.hydrophila的報道越來越多，尤其對人工養殖的魚類危害較大。該試驗從采集青島地區人工養殖場中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份分離到50株致病性A.hydrophila，說明A.hydrophila在許氏平鮋養殖中流行嚴重，可能對許氏平鮋存在潛在危害性，應該引起重視。

臨床中A.hydrophila病主要通過抗菌藥物進行防治，隨著抗菌藥物的不合理使用，對青霉素、頭孢菌素類、氨基糖苷類等藥物產生較強的耐藥性，其耐藥性菌株不斷出現，同一地區不同養殖場的耐藥性也存在差異性，降低了治療效果^[11]。該研究表明，50株A.hydrophila對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9種藥物耐藥率在52.0%以上，對其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。說明從許氏平鮋養殖中分離的A.hydrophila對臨床中常用的藥物存在不同耐藥性，且耐藥性嚴重。因此，在臨床中治療該病應該進行藥物試驗，選擇敏感的藥物進行交替使用，同時應該配合環境的消毒，提高治療效果。

參考文獻：

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Isolation and identification of Aeromonas hydrophila? of Sebastes schlegelii origin and drug sensitivity test

LI Hui

（Dalian Ocean Development Affairs Service Center， Dalian 116000， Liaoning China）

Abstract：To understand the prevalence and drug resistance of Aeromonas hydrophila， the pathogenic bacterium of Sebastes schlegelii， in captive culture in Qingdao. The pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by using the conventional bacterial isolation and identification method and PCR method， and the pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by the artificial infection animal test and K-B drug-sensitive paper test， respectively. The results showed that the pathogenicity and drug resistance of the isolates were determined by the K-B drug-sensitive paper method. The results showed that 68 strains of Aeromonas hydrophila were isolated from 127 samples， and the isolation rate was 53.5% （68/127）. 50 strains of Aeromonas hydrophila could cause the death of Sebastes schlegelii as pathogenic strains. The resistance rate of 50 strains of Sebastes schlegelii to 9 drugs， including neomycin， florfenicol and spectinomycin， was 52.0% and 4.0%-30% for other drugs. This study provides a reference for the rational drug use and prevention and control of Aeromonas hydrophila of Sebastes schlegelii.

Keywords：redfish （Sebastods schlegelii）; Aeromonas hydrophila; Isolation and identification; Pathogenicity; Drug sensitivity test