非編碼RNA來源的小肽：“微不足道”卻“功能強(qiáng)大”*

陳曉彤，趙文龍，孫林玉，王文濤，陳月琴

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及ENCODE 計(jì)劃的開展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，約75%的基因組可以產(chǎn)生 轉(zhuǎn) 錄 本（Derrien et al.，2012；Djebali et al.，2012）。早期對(duì)于蛋白質(zhì)編碼基因的鑒定和注釋主要集中在以ATG起始的能夠編碼至少100個(gè)氨基酸的多肽的ORF，因此過去普遍認(rèn)為，能夠形成遺傳信息最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)編碼基因僅占整個(gè)基因組的2%，剩余的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成了非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組（Derrien et al.，2012；Djebali et al.，2012；Guttman et al.，2013）。在非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄組中，長鏈非編碼RNA 是數(shù)量最多的成員，在各種生物學(xué)過程中扮演了重要的角色，包括維持細(xì)胞干性、調(diào)控生長發(fā)育以及參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等重大生命活動(dòng)（Esteller，2011；Hangauer et al.，2013；Wang et al.，2013a；Iyer et al.，2015；Braz?o et al.，2016；Delás et al.，2017）。

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展，越來越多的研究表明，一些傳統(tǒng)上被認(rèn)為不編碼蛋白的RNA 區(qū)域（包括長鏈非編碼RNA以及信使RNA（mRNA，messenger RNA ）的5’和3’非翻譯區(qū)（UTR，untranslated region）等）實(shí)際上也存在開放閱讀框（ORF，open reading frame）（Orr et al.，2020）。這些開放閱讀框的長度通常小于300 nt（nucleotide），被稱為小開放閱讀框（Orr et al.，2020）。由核糖體印記技術(shù)（ribosome footprint pro‐filing）發(fā)展而來的翻譯組測序（Ribo-Seq，ribosome profiling sequencing），為發(fā)現(xiàn)新的翻譯模式提供了技術(shù)手段（Ingolia et al.，2012）。Ribo-Seq 結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)（MS，mass spectrometry），許多sORF 被發(fā)現(xiàn)可以翻譯出長度通常小于100 個(gè)氨基酸的小肽（Slavoff et al.，2013）。這些長度短于100個(gè)氨基酸的小肽在生物體內(nèi)發(fā)揮重要功能，包括參與個(gè)體發(fā)育、肌肉收縮和DNA 修復(fù)等（Lu et al.，2004；Ma et al.，2014；Ma et al.，2016；Olexiouk et al.，2018）。

由于這些非編碼RNA 來源的小肽長期以來被認(rèn)為并不存在，所以被稱為“幽靈蛋白質(zhì)組”（ghost proteome）或“隱藏的蛋白質(zhì)組”（hidden proteome）（Yang et al.，2019；Cardon et al.，2021）。當(dāng)前，功能性 sORF 的鑒定已成為基因組注釋中的主要挑戰(zhàn)，本文將從非編碼RNA 來源小肽的鑒定方法、可編碼小肽的非編碼RNA 種類、小肽的功能等幾個(gè)方面來系統(tǒng)綜述這類新發(fā)現(xiàn)的小肽，重點(diǎn)論述這類小肽的功能機(jī)制，以期為非編碼RNA 來源小肽的系統(tǒng)鑒定、編碼規(guī)律和功能研究提供新視角。

1 非編碼RNA來源小肽的鑒定方法

小肽由于其肽段長度較短，容易降解等特點(diǎn)，難以被傳統(tǒng)翻譯分析方法所捕捉。因此，為了探尋當(dāng)前未注釋和未充分研究的“隱藏蛋白質(zhì)組”，需要更精準(zhǔn)的鑒定方法。

翻譯起始的標(biāo)準(zhǔn)掃描模型認(rèn)為，核糖體與RNA 5’帽結(jié)構(gòu)結(jié)合形成起始前復(fù)合體，該復(fù)合體在mRNA 上掃描，當(dāng)發(fā)現(xiàn)以起始密碼子AUG 為中心的Kozak序列后開始進(jìn)行翻譯且多肽延伸，直至遇到終止密碼子結(jié)束翻譯，核糖體從轉(zhuǎn)錄本上脫落（Moteki et al.，2002；Sonenberg et al.，2009）。由于翻譯的場所在細(xì)胞質(zhì)，而核內(nèi)的ncRNA 無法接觸翻譯機(jī)器，因此對(duì)于具有潛在翻譯能力的ncRNA 的初步篩選是尋找具有m7G 結(jié)構(gòu)且定位于胞質(zhì)的ncRNA（A）。（1）分析ncRNA 序列是否具有7-甲基鳥苷（m7G）帽子結(jié)構(gòu)以及Kozak 序列；（2）利用核質(zhì)分離以及熒光原位雜交（FISH，fluores‐cence in situ hybridization）實(shí)驗(yàn)，檢測ncRNA 是否穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中。

除了標(biāo)準(zhǔn)掃描模型外，核糖體還存在泄露掃描、分流、通讀和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES，internal ribosome entry site）等替代翻譯模式，研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)真核生物的蛋白質(zhì)編碼基因缺乏最佳的Kozak區(qū)間序列，且翻譯可以在近源起始密碼子（CUG/GUG/ACG 等）處起始（Ivanov et al.，2011；Kearse et al.，2017；Yang et al.，2019；Cao et al.，2020）。Ribo-Seq 從多核糖體復(fù)合物中提取完整的RNA 轉(zhuǎn)錄物，并通過核酸酶處理降解未受核糖體結(jié)合保護(hù)的RNA 片段，因此可預(yù)測潛在的sORF（Olexiouk et al.，2018）。因此，通過結(jié)合Ribo-Seq 技術(shù)可以全局鑒定具有潛在翻譯能力的ncRNA。翻譯起始測序（TI-Seq，translation initia‐tion sequencing）通 過lactimidomycin（LTM）或harringtonine （HARR）等翻譯抑制劑誘導(dǎo)核糖體在起始密碼子處阻滯，可預(yù)測起始密碼子，特別是非經(jīng)典起始密碼子（Ingolia et al.，2012）（B）。

一些研究顯示ncRNA 本身可以通過結(jié)合核糖體發(fā)揮翻譯調(diào)控功能（Carrieri et al.，2012；Yoon et al.，2012；Tran et al.，2016）。因此，為了排除核糖體僅停留在ncRNA 上不進(jìn)行翻譯的情況，需要進(jìn)一步確認(rèn)ncRNA 上的開放閱讀框是否能夠進(jìn)行有效翻譯。通常可采用以下方法：（1）生物信息學(xué)預(yù)測。通過RNA 編碼預(yù)測工具，例如sORFfinder（Hanada et al.，2010），PhyloCSF（Lin et al.，2011），CPAT（Wang et al.，2013b），CPC/CPC2（Kong et al.，2007；Kang et al.，2017），IRESite（Mokrejs et al.，2006），M6AMRFS（Qiang et al.，2018）等，尋找ncRNA 上潛在的開放閱讀框，并通過查找序列上下區(qū)間中的翻譯調(diào)節(jié)元件（如IRES、m6A修飾等）進(jìn)行序列的編碼能力預(yù)測（圖1C）；（2）保守性分析，功能編碼序列通常表現(xiàn)出較高的跨物種密碼子保守性，雖然lncRNA 保守性比mRNA 低，但通常具有功能活性的蛋白編碼ORF 序列保守性比較高，因此可以通過分析序列片段的保守性來尋找有效ORF（圖1D）。（3）轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。通過Ribo-Seq 測序技術(shù)可以檢測核糖體結(jié)合的ncRNA 轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析算法可以對(duì)潛在的活躍翻譯ORF實(shí)現(xiàn)密碼子分辨率的預(yù)測。

圖1 非編碼RNA來源小肽的鑒定方法Fig.1 Methods for identification of small peptides derived from non-coding RNA

sORF 編碼的小肽通常比蛋白質(zhì)更易降解，ncRNA 如果翻譯了卻沒有產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，那么核糖體通讀產(chǎn)生的小肽可能只是一個(gè)副產(chǎn)物。因此對(duì)蛋白是否真實(shí)表達(dá)并且穩(wěn)定存在的檢測非常重要，可通過以下5種方式篩選。（1）質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜技術(shù)提供小肽存在的直接證據(jù)，可以鑒定小肽在生理?xiàng)l件下的氨基酸組成以及豐度（圖1E）。（2）標(biāo)簽肽驗(yàn)證。在ORF 序列N 或C 末端進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)記，通過蛋白質(zhì)印跡法（western blot）驗(yàn)證標(biāo)簽肽是否翻譯。（3）內(nèi)源抗體檢測。生產(chǎn)靶向小肽的特異氨基酸序列抗體，通過western blot 確認(rèn)小肽的大小是否與預(yù)期相符，在內(nèi)源細(xì)胞系樣品中驗(yàn)證小肽在體內(nèi)條件下是否真實(shí)存在（圖1F）。（4）體外翻譯。將ncRNA 全序列經(jīng)過原核/真核體外轉(zhuǎn)錄以及翻譯系統(tǒng)，結(jié)合35S同位素放射性自顯影技術(shù)，檢測ncRNA 是否可以翻譯小肽以及可以翻譯幾條小肽。（5）開放閱讀框突變。使用起始密碼子突變或者移碼突變，可以確認(rèn)開放閱讀框及其產(chǎn)生小肽的準(zhǔn)確性。

2 可編碼小肽的非編碼RNA種類

非編碼RNA 在轉(zhuǎn)錄組中占據(jù)極大的比例，形成了高度復(fù)雜的家族，包括長非編碼RNA（lncRNA，long non-coding RNA）、微小RNA（miRNA，microRNA ）、環(huán)狀RNA（circRNA，circular RNA ）、核 糖 體RNA （rRNA，ribosome RNA）、小 干 擾RNA （siRNA，small interfering RNA）等（Kapranov et al.，2007）。目前對(duì)于非編碼翻譯的研究主要集中在包括mRNA 的5’和3’UTR 以及l(fā)ncRNA、pri-miRNA 和circRNA 等非編碼RNA 區(qū)域中（Orr et al.，2020）。

2.1 mRNA非翻譯區(qū)（UTR）

UTR 位 于 成 熟mRNA 兩 端，分 為5’UTR 和3’UTR。過去認(rèn)為UTR 通常不編碼蛋白質(zhì)，主要行使對(duì)蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS，coding sequence）的翻譯調(diào)控功能（圖2A）。隨著越來越多的sORF 在UTR 區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，人們將位于mRNA 的5’UTR 上的ORF 命名為上游ORF（upORF，upstream ORF），位于3’UTR 的ORF 稱為下游ORF（dORF，down‐stream ORF）（Calvo et al.，2009；Couso et al.，2017；Wu et al.，2020a）。

圖2 可編碼小肽的非編碼RNA種類Fig.2 Classification of non-coding RNA encoding micropeptides

sORF 在5’UTR 中大量存在，根據(jù)終止密碼子的位置，upORF 可分為完全上游ORF（cuORF，completely upstream ORF）和 上 游 重 疊 ORF（uoORF，upstream overlapping ORF）（Calvo et al.，2009；Ye et al.，2015）。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多具有較長5’UTR 的轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)翻譯水平會(huì)顯著下降，upORF 的存在可能會(huì)翻譯產(chǎn)生小肽，進(jìn)而導(dǎo)致核糖體在mRNA 上的提前脫離，通過阻止部分或全部核糖體對(duì)CDS 區(qū)的掃描來抑制mRNA 的常規(guī)蛋白翻譯（Calvo et al.，2009；Ye et al.，2015）。當(dāng)然upORF 不一定總會(huì)影響CDS 的翻譯，這取決于upORF 的終止密碼子與CDS 區(qū)的距離，以及upORF 前后序列的起始能力強(qiáng)弱（Wagner et al.，2020）。Rodriguez et al.（2019）發(fā)現(xiàn)31% 的神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄本中，一共鑒定了4 954 個(gè)可翻譯的upORFs，且主要是通過非經(jīng)典起始密碼子起始翻譯，所得小肽可以作為CDS 翻譯的順式調(diào)節(jié)因子。例如，從GADD34 的5’UTR 中的upORF 翻譯而來的SEP 通過C 端保守的3’氨基酸序列介導(dǎo)核糖體釋放從而抑制主CDS 的翻譯（Young et al.，2015）。相比upORF，位于3’UTR 上的dORF 的功能較少被報(bào)道，其中一些dORF 的翻譯也被證實(shí)參與主CDS 的翻譯調(diào)控中（Couso et al.，2017；Wu et al.，2020b）。例如Wu et al.（2020b）發(fā)現(xiàn)dORF 可作為CDS的翻譯增強(qiáng)子，當(dāng)對(duì)dORF的起始密碼子進(jìn)行突變以抑制其翻譯時(shí)，CDS 的表達(dá)水平隨之降低，暗示了dORF 編碼的小肽與CDS 翻譯之間存在的聯(lián)系。

2.2 長鏈非編碼RNA （lncRNA）

相對(duì)于其他非編碼RNA，lncRNA 具有數(shù)量眾多并且功能多樣等特點(diǎn)，在可產(chǎn)生小肽的非編碼RNA 中，lncRNA 是最被關(guān)注的一類ncRNA（圖2B）。與其他非編碼RNA 不同的是，大部分lncRNA 與mRNA 有著相似的特點(diǎn)。例如，它們均由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄出來，轉(zhuǎn)錄完成后均有m7G加帽以及Poly A 加尾的過程，經(jīng)過可變剪切的加工，并且它們都容易在細(xì)胞質(zhì)聚集，這些特點(diǎn)使得lncRNA 具備翻譯小肽的潛能（Ruiz-Orera et al.，2014）。目前發(fā)現(xiàn)一些lncRNA 編碼功能小肽，如lncRNA ASHIL-AS1 編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的小肽APPLE，通過調(diào)控翻譯維持癌細(xì)胞高速合成，促進(jìn)AML發(fā)展（Sun et al.，2021）；lncRNA HOXB-AS3編碼保守的53 aa（amino acids）小肽，通過調(diào)節(jié)腫瘤能量代謝來抑制結(jié)直腸癌（CRC，colorectal carcinoma）細(xì)胞的生長、集落形成、遷移、侵襲和腫瘤發(fā)生（Huang et al.，2017）；LINC00691編碼的小肽SPAR可以調(diào)控肌肉細(xì)胞的再生能力等（Matsumoto et al.，2017）。但是也有研究提出質(zhì)疑，認(rèn)為僅僅是RNA 結(jié)構(gòu)以及核糖體的結(jié)合并不能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的絕對(duì)可翻譯條件，實(shí)驗(yàn)污染會(huì)導(dǎo)致核糖體結(jié)合的RNA中不僅有l(wèi)ncRNA，還包括了一些核內(nèi)的非編碼RNA。這些核內(nèi)非編碼RNA 由于空間阻斷缺乏翻譯機(jī)會(huì)；而采用核糖體釋放速率算法可以將核糖體結(jié)合lncRNA 與翻譯的mRNA 顯著區(qū)分，這暗示了大量與核糖體結(jié)合lncRNA 可能未被真實(shí)翻譯（Guttman et al.，2013）。的確，也有研究表明lncRNA可通過結(jié)合核糖體參與mRNA翻譯調(diào)控中，如LincRNA-p21（Yoon et al.，2012）、AS-RBM15（Tran et al.，2016）以及antisense Uchl1（Carrieri et al.，2012）等均結(jié)合在核糖體上，但是不翻譯成小肽，而是以RNA 的形式發(fā)揮翻譯調(diào)控的功能。這些研究表明，功能小肽的準(zhǔn)確鑒定仍然具有很大挑戰(zhàn)。

2.3 環(huán)狀RNA （circRNA）

環(huán)狀RNA 是一類共價(jià)閉合單鏈RNA，由前體轉(zhuǎn)錄本（pre-RNA）的可變剪接而來，包括內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA 和外顯子來源的環(huán)狀RNA，后者占總環(huán)狀RNA 比重最大（Li et al.，2018）。與經(jīng)典RNA順式剪接不同，外顯子來源環(huán)狀RNA由RNA的反式剪接生成。在成環(huán)過程中，外顯子序列中上游外顯子3’剪切位點(diǎn)同下游外顯子5’剪切位點(diǎn)剪切連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成成熟的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本（Ashwal-Fluss et al.，2014；Zhang et al.，2014；Ivanov et al.，2015；Starke et al.，2015；Wang et al.，2015）。由此可見，環(huán)狀RNA具有環(huán)化以及部分基因的外顯子序列，因此，具有潛在ORF 的特點(diǎn)，暗示了環(huán)狀RNA 具有翻譯的潛能（圖2C）。此外，大部分環(huán)狀RNA 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在空間上為環(huán)狀RNA 的翻譯提供了可行性（Sinha et al.，2022）。

與mRNA 不同，環(huán)狀RNA 的閉合結(jié)構(gòu)使其缺少5’端m7G 帽子，導(dǎo)致翻譯起始復(fù)合物eIF4F無法結(jié)合并介導(dǎo)核糖體進(jìn)入環(huán)狀RNA 從而啟動(dòng)翻譯過程（Jeck et al.，2013；Guo et al.，2014；Schneider et al.，2016）。近年來陸續(xù)有文章報(bào)道環(huán)狀RNA 上存在多個(gè)開放閱讀框，并且可以通過帽子非依賴途徑實(shí)現(xiàn)核糖體進(jìn)入，這些途徑包括：（1）通過IRES介導(dǎo)的翻譯起始。研究表明，許多環(huán)狀RNA 上存在IRES序列，這些IRES序列可以通過自身結(jié)構(gòu)或者結(jié)合帽子非依賴翻譯起始蛋白來招募核糖體起始翻譯（Yang et al.，2019）。（2）通過m6A 甲基化修飾介導(dǎo)的翻譯起始（Yang et al.，2017a）。研究表明mRNA 5’UTR 上存在的m6A 修飾可以介導(dǎo)帽子非依賴的翻譯起始過程，由于m6A 修飾在環(huán)狀RNA上分布廣泛，環(huán)狀RNA 可以通過m6A 閱讀蛋白YTHDF3 招募翻譯起始復(fù)合物與核糖體從而起始翻譯（Legnini et al.，2017；Pamudurti et al.，2017；Yang et al.，2017a）。

盡管大部分環(huán)狀RNA 自身序列并不是很長，但是由于其共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)，開放閱讀框可以跨過成環(huán)位點(diǎn)直到出現(xiàn)終止密碼子（Liang et al.，2019；Zhang et al.，2021）。因此，一部分環(huán)狀RNA編碼的“小肽”會(huì)超過100個(gè)氨基酸，包括 SHPRH-146aa（Begum et al.，2018）、AKT3-174aa（Xia et al.，2022）、FBXW7-185aa（Yang et al.，2018）、circDIDO1-529aa（Zhang et al.，2021）和 β-catenin-370aa（Liang et al.，2019）等。然而，很多具有明顯IRES元件和開放閱讀框的環(huán)狀RNA 無法翻譯出蛋白，提示明確環(huán)狀RNA 翻譯規(guī)律仍是一個(gè)亟須解決的科學(xué)問題。最近研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的翻譯亦或受到壓力影響，例如細(xì)胞饑餓可以增強(qiáng)circMbl翻譯效果（Pamudurti et al.，2017）；熱刺激可以促進(jìn)包含m6A 的環(huán)狀RNA表達(dá)報(bào)告基因如綠色熒光蛋白GFP（Yang et al.，2017a）。這些研究進(jìn)展表明了部分環(huán)狀RNA 翻譯具有一定的時(shí)空特異性。

2.4 pri-miRNA

miRNA 的生物發(fā)生包括兩個(gè)步驟：（1）通過RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)miRNA （pri-miRNA）轉(zhuǎn)錄物；（2）由Dicer like 1 （DCL1）蛋白將primiRNA 加工成前體miRNA（pre-miRNA）和最終成熟miRNA（Carthew et al.，2009）。最近研究表明，原始病毒可能含有編碼調(diào)節(jié)性小肽（miPEPs）的短開放閱讀框（圖2D）。這些短肽影響相關(guān)miRNA 的積累（Fang et al.，2017；Lauressergues et al.，2015）。雖然，這種調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍未被破譯，但是目前 已 經(jīng) 證 明miPEPs、miPEP171d、miPEP172c、miPEP858a和miPEP165a可以調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育（Yadav et al.，2021）。

關(guān)于pri-miRNAs 的肽編碼潛力的第一個(gè)證據(jù)是：Lauressergues et al.（2015）發(fā)現(xiàn)，蒺藜狀苜蓿的pri-miRNA171b 和唐松草的pri-miR165a 含有編碼調(diào)節(jié)肽的sORF。這些短肽特異性地正向調(diào)節(jié)其相應(yīng)成熟miRNA 的積累。MiPEP171b 過表達(dá)導(dǎo)致側(cè)根密度降低，與miPEP171b 過表達(dá)植株的表型一樣。類似地，miPEP165a 過表達(dá)導(dǎo)致根伸長。此外，為了驗(yàn)證miPEP 過表達(dá)和相應(yīng)miRNA 積累之間的正相關(guān)性，同時(shí)分析了其他5 種主要miRNAs的 開 放 閱 讀 框。這 些miPEP （miPEP 160b、miPEP164a、miPEP319、miPEP169d 和miPEP171e）的過度表達(dá)或外部應(yīng)用導(dǎo)致其相應(yīng)miRNAs的更高積累（Lauressergues et al.，2015）。

2.5 核糖體RNA （rRNA）

核糖體RNA 編碼小肽的報(bào)道較少（圖2E）。目前發(fā)現(xiàn)線粒體16S rRNA 編碼的小肽Humanin 參與細(xì)胞凋亡等多種生命活動(dòng)的調(diào)控（Lee et al.，2013）、線粒體12S rRNA 編碼的小肽MOTS-c 可以通過調(diào)控胰島素敏感性來抑制飲食誘導(dǎo)的肥胖（Lee et al.，2015）。

3 小肽的功能

雖然近年來在真核基因轉(zhuǎn)錄本中挖掘出大量的sORF，但是目前已被鑒定的具有體內(nèi)翻譯能力和生物活性的小肽數(shù)量仍非常少（Vitorino et al.，2021）。越來越多的研究證實(shí)，小肽在哺乳動(dòng)物和植物中均有存在，且在多種生物進(jìn)程中發(fā)揮著重要功能，如RNA 去帽過程、DNA 修復(fù)、壓力通路、凋亡、肌肉形成、代謝穩(wěn)態(tài)、鈣離子穩(wěn)態(tài)等（Yeasmin et al.，2018）。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，編碼小肽的非編碼RNA如lncRNA往往在癌癥中異常表達(dá)，并可以編碼與患者總生存期和治療反應(yīng)相關(guān)的小肽。這些研究結(jié)果提示非編碼RNA 來源的小肽可能參與癌癥發(fā)生發(fā)展，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值（Hanahan et al.，2011；Merino-Valverde et al.，2020；Wu et al.，2020b；Ye et al.，2020 ；Prensner et al.，2021）。研究顯示許多小肽在癌癥中失調(diào)表達(dá)，通過調(diào)節(jié)增殖、凋亡、代謝和細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響腫瘤進(jìn)程（Yang et al.，2017b；Zhang et al.，2018）。在植物中，也發(fā)現(xiàn)可以通過外源合成pri-miRNA來源的小肽來改善植物的農(nóng)藝性狀（Yadav et al.，2021）。

3.1 小肽參與調(diào)控細(xì)胞增殖

在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞通過嚴(yán)格控制有絲分裂信號(hào)來維持正常的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)。相比之下，癌細(xì)胞最突出的特點(diǎn)就是過度的有絲分裂導(dǎo)致的無限增殖以及永生化（圖3A）。最近研究表明，一些小肽參與調(diào)節(jié)了癌細(xì)胞的有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)（Polycarpou-Schwarz et al.，2018；Pang et al.，2020；Xu et al.，2020；Zheng et al.，2021）。在癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)的小肽通常通過激活信號(hào)通路來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。例如，癌癥相關(guān)小整體膜開放閱讀框1（CASIMO1，cancer-associated small integral membrane open reading frame 1）來源于非編碼RNA NR_029453上的一個(gè)sORF，在乳腺癌中顯著高表達(dá)（Polycarpou-Schwarz et al.，2018）。研究發(fā)現(xiàn)CASIMO1 編碼的小肽SMIM22 與角鯊烯環(huán)氧化酶（SQLE，squalene epoxidase）相互作用，導(dǎo)致SQLE 蛋白積累和脂滴聚集增加，SQLE 蛋白可促進(jìn)ERK 磷酸化和MAPK 通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致G0 / G1 細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。同樣，circPPP1R12A 編碼的功能小肽circPPP1R12A-73aa（PPP1R12A-C），在結(jié)直腸癌組織中顯著增加，通過激活 Hippo-YAP 信號(hào)通路促進(jìn)CRC 生長和轉(zhuǎn)移（Zheng et al.，2021）。LINC00998 編 碼 的 小 肽SMIM30 在肝癌患者中高度表達(dá)，SIMM30 與非受體酪氨酸激酶 SRC/YES1 結(jié)合，驅(qū)動(dòng)其膜錨定和磷酸化，激活下游MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移（Pang et al.，2020）。相反，在癌細(xì)胞中顯著低表達(dá)的小肽則發(fā)揮了抑制癌細(xì)胞生長增殖的作用。例如，lncRNA NCBP2-AS2 編碼的小肽KRASIM 與KRAS 蛋白及其蛋白水平相互作用，抑制ERK 信號(hào)活性，從而抑制肝細(xì)胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的細(xì)胞生長和增殖（Xu et al.，2020）。

圖3 小肽的功能Fig.3 The function of micropeptides

sORFs除了通過調(diào)控信號(hào)通路來影響有絲分裂之外，還可以通過其他方式調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖。例如，lncRNA LINC00467 編碼的ATP 合酶相關(guān)肽（ATP synthase-associated peptide，ASAP），通過與ATP5A 和 ATP5C 相互作用提高 ATP 合酶活性和線粒體耗氧率，從而促進(jìn)體外和體內(nèi)CRC 細(xì)胞增殖（Ge et al.，2021）。LINC-PINT 編 碼 的 小 肽PINT87aa 與forkhead box M1（FOXM1）的 DNA 結(jié)合域結(jié)合，減少其靶基因抑制素2（prohibitin 2，PHB2）的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗增殖和抗衰老作用（Xiang et al.，2021）。circPINTexon2 編 碼 的PINT87aa直接與聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物 （polymerase associated factor complex，PAF1c）相互作用，參與PAF1/RNA Ⅱ 聚合酶復(fù)合物調(diào)控，使RNA 聚合酶Ⅱ在特定癌基因啟動(dòng)子（如細(xì)胞周期蛋白D1、CPEB1、c-MYC 和SOX2）處暫停，從而在體外和體內(nèi)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖（Zhang et al.，2018）。在結(jié)腸癌中低表達(dá)的HOXB-AS3 peptide 可以通過調(diào)控mRNA 的可變剪切來影響癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲（Huang et al.，2017）。

3.2 小肽參與調(diào)控細(xì)胞凋亡

調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和存活之間的平衡對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡作為一種由基因編程的自主細(xì)胞死亡形式，是正常發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)所必需的（Delbridge et al.，2012；Childs et al.，2014；Aubrey et al.，2018）。研究表明，一些非編碼RNA來源的小肽參與細(xì)胞凋亡功能調(diào)控。lncRNA LINC00278 編碼小肽YY1BM（Yin Yang 1-binding micropeptide），可在營養(yǎng)剝奪下通過雄激素受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC，esophageal squamous cell carcinoma）中具有腫瘤抑制活性（Wu et al.，2020c）。在腫瘤內(nèi)注射純化的小肽YY1BM 在異種移植模型中顯示出治療效果，表明其具有作為腫瘤抑制劑的潛力。同樣，胃腸道特異性lncRNA LINC00675 被發(fā)現(xiàn)可編碼小肽FORCP（FOXA1-regulated conserved small protein），在CRC 中顯著低表達(dá)。FORCP 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER，endoplasmic reticulum），通過與BRI3BP 相互作用從而抑制CRC細(xì)胞增殖，并在ER 應(yīng)激下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Li et al.，2020）。

線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心，多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途徑。Humanin是在線粒體基因組中鑒定出的第一個(gè)sORF，由線粒體16S rRNA 編碼，研究發(fā)現(xiàn)Humanin 可通過介導(dǎo)BCL-2蛋白質(zhì)家族的細(xì)胞內(nèi)定位來調(diào)節(jié)內(nèi)源性或線粒 體 凋 亡 途 徑（Guo et al.，2003；Luciano et al.，2005；Lee et al.，2013）。Humanin 可上調(diào)BCL-2 的表達(dá)并抑制BAX 表達(dá)以抑制細(xì)胞凋亡（Guo et al.，2003）。此外，Humanin 還可以與其他BCL-2 蛋白家族成員（如BID 和BAX）相互作用，并調(diào)節(jié)它們的易位以抑制凋亡體的產(chǎn)生（Luciano et al.，2005）。PIGBOS 是一種由PIGB 基因的反義鏈RNA 編碼的新型小肽，定位于線粒體外膜，通過CLCC1 蛋白與ER 相互作用，PIGBOS 的下調(diào)通過增加對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的UPR 的敏感性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Chu et al.，2019）。雖然PIGBOS功能的分子機(jī)制尚未被描述，但有理由認(rèn)為，其可能通過使細(xì)胞對(duì)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR，unfolded protein response）敏感并迫使它們進(jìn)入細(xì)胞凋亡，其在癌細(xì)胞中的抑制可能具有治療潛力。

3.3 小肽參與調(diào)控細(xì)胞物質(zhì)代謝與能量代謝

細(xì)胞代謝是指細(xì)胞通過對(duì)葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等燃料的分解，產(chǎn)生用于細(xì)胞活動(dòng)的ATP（Judge et al.，2020）。這些過程主要發(fā)生在人體的能量工廠——線粒體中，并需要多種酶和輔助因子的參與（Fernie et al.，2004）。實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和生物信息學(xué)分析均表明，小肽在線粒體內(nèi)膜（IMM，inner mitochondrial membrane）上大量富集，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)（Kim et al.，2017）（圖3C）。小肽BRAWNIN 由C12orf73 基因編碼，在心臟和骨骼肌細(xì)胞中高度表達(dá)并定位于IMM 中（Zhang et al.，2020）。小肽BRAWNIN 通過與UQCRC1 的相互作用來促進(jìn)呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（CIII，respiratory chain complex Ⅲ）組裝，通過反饋回路調(diào)節(jié)細(xì)胞能量狀態(tài)。敲低BRAWNIN 可導(dǎo)致細(xì)胞ATP 合成減少，從而促進(jìn) AMPK 活化。小肽Mtln 與BRAWNIN類似，在心臟和骨骼肌中高表達(dá)，與線粒體三功能蛋白（MTP，mitochondrial trifunctional protein）的亞基HADHB 互作，因此，Mtln 被認(rèn)為參與脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)（Makarewich et al.，2018）。除MTP 外，Mtln 還與心磷脂相互作用，心磷脂對(duì)于維持膜完整性和組裝呼吸用多蛋白復(fù)合物至關(guān)重要（Stein et al.，2018）。Mtln 的過表達(dá)增加了基礎(chǔ)和最大呼吸速率，減少了糖酵解（Chugunova et al.，2019）。

LncRNA HOXB-AS3被證明可以翻譯產(chǎn)生參與RNA 剪接的53AA 小肽。Huang 及其合作者發(fā)現(xiàn)，HOXB-AS3 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中下調(diào)，改變了丙酮酸激酶M（PKM，pyruvate kinase M）前mRNA 的剪接形式，重新表達(dá)胚胎同種型PKM2，有利于糖酵解活性；與此同時(shí)，HOXB-AS3 來源小肽的表達(dá)有利于促進(jìn)氧化磷酸化的成體亞型（PKM1）的表達(dá)。總的來說，HOXB-AS3 來源小肽在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的過表達(dá)可以通過改變其對(duì)葡萄糖代謝的使用而減弱其致癌能力（Huang et al.，2017）。線粒體基因組12s rRNA 上的開放閱讀框編碼的小肽MOTS-c 被發(fā)現(xiàn)在體外可增加葡萄糖攝取、糖酵解活性和AMPK 活化，同時(shí)降低耗氧率，改善了與體內(nèi)肥胖相關(guān)的代謝參數(shù)（Lee et al.，2015）。

3.4 小肽調(diào)控炎癥免疫通路

炎癥是由先天免疫系統(tǒng)發(fā)起的一系列細(xì)胞反應(yīng)，通過消除病原體以及恢復(fù)細(xì)胞和機(jī)體穩(wěn)態(tài)來維持宿主健康（El-Kenawi et al.，2017；Evavold et al.，2019；Medzhitov，2008）。已有研究表明，線粒體為免疫細(xì)胞識(shí)別外來抗原以及合成促炎細(xì)胞因子和趨化因子提供能量，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面起 關(guān) 鍵 作 用（Subramanian et al.，2013；Jo et al.，2016；West et al.，2017；Forrester et al.，2018；Neagu et al.，2019；Andrieux et al.，2021）。小肽在線粒體中的富集也暗示其對(duì)細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控作用（Kim et al.，2017）（圖3D）。

炎癥小體是一種大分子蛋白復(fù)合物，其中IL-1β前體通過半胱天冬酶1（caspase 1）轉(zhuǎn)化為生物活性IL-1β，引發(fā)IL-1介導(dǎo)的炎癥（Weber et al.，2010）。線粒體小肽-47（Mm47，mitochondrial micropeptide-47）被發(fā)現(xiàn)在活化的巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)，其對(duì)免疫刺激的下調(diào)和線粒體定位使其在Nlrp3 介導(dǎo)的炎性小體反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用（Bhatta et al.，2020）。然而，Mm47 在調(diào)節(jié)Nlrp3 寡聚化程度和OMM 招募方面的分子機(jī)制仍然未知。此外，線粒體小肽MOTS-c 和Humanin 也被報(bào)道能夠通過調(diào)節(jié)衰老細(xì)胞的線粒體活性來加劇衰老相關(guān)分泌表型（SASP，senescence-associated secretory phenotype）的促炎作用（Kim et al.，2018；Mendelsohn et al.，2018）。

3.5 小肽調(diào)控植物生長發(fā)育

在植物中，近年研究發(fā)現(xiàn)pri-miRNA編碼的小肽（miPEPs）發(fā)揮了重要的作用，特別是在農(nóng)藝性狀方面。miR172c 是大豆結(jié)瘤的正向調(diào)節(jié)因子（Wang et al.，2019），其過度表達(dá)導(dǎo)致結(jié)節(jié)數(shù)量的增加，抑制則具有相反的效果。Couzigou et al.（2016）表明，用合成的大豆miR172c 前體編碼的小肽miPEP172c 處理大豆可顯著增加根瘤數(shù)，而不影響其他根系發(fā)育特征，與在大豆中過量表達(dá)miR172c 的結(jié)果一致。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，用miPEP172c 處理大豆還可以增加了miR172c 的積累，說明小肽miPEP 可以上調(diào)miRNAs 表達(dá)（圖3E）。并且，與對(duì)照植株相比，經(jīng)miPEP172c處理的植株中ENOD40–1、NIN、NSP1 和Hb2 表達(dá)也顯著提高，表明miPEP172c 在植物發(fā)育過程以及植物-微生物相互作用中都發(fā)揮重要作用。這些進(jìn)展揭示了調(diào)節(jié)性miPEPs 在改善作物農(nóng)藝性狀中的重要性。

類似地，發(fā)現(xiàn)由pri-miR858a 編碼的小肽miPEP858a 調(diào)節(jié)擬南芥類黃酮的生物合成和發(fā)育（Sharma et al.，2020）。外源應(yīng)用合成的miPEP858a可恢復(fù)由miPEP858a 缺失導(dǎo)致的擬南芥植物發(fā)育缺陷。此外，啟動(dòng)子報(bào)告基因分析表明，miPEP858a 具有調(diào)控自身啟動(dòng)子活性和GUS 基因轉(zhuǎn)錄的作用，暗示miPEPs 具有特定的生物學(xué)功能（圖3F）。

不定根的形成是葡萄無性繁殖的主要障礙。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了外施miR-171d 編碼的小肽miPEP171d1 在不定根形成中的重要作用（Chen et al.，2020）。將外源miPEP171d1 導(dǎo)入歐洲葡萄組培苗中，可促進(jìn)miR171d 的積累和不定根的發(fā)育（圖3G）。這些結(jié)果顯示了一種新的miRNA 調(diào)節(jié)機(jī)制，該機(jī)制與其相關(guān)的miPEP 有關(guān)。在擬南芥中，通過對(duì)pri-miRNA 來源小肽miPEP164a、miPEP165a和miPEP319a 等的研究（Yadav et al.，2021），發(fā)現(xiàn)這些小肽對(duì)植株生長都具有明顯的促進(jìn)作用。與對(duì)照植株相比，噴灑、澆水、堆肥、添加肥料等外施miPEPs 的植株在莖高、早花、花數(shù)增加和花柄高度方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。外源施用miPEPs時(shí)，植株內(nèi)的miPEP 總量增加，因此總體上調(diào)節(jié)了相關(guān)miRNAs 的積累。有趣的是，miPEPs 可以在外源施用下發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)將在農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途。

在蒺藜苜蓿中外施和過表達(dá)miPEP171b 均能使植株內(nèi)的miR171b 表達(dá)升高并抑制其靶基因（Lauressergues et al.，2015）（圖3H）。miPEP171b1過表達(dá)導(dǎo)致MtmiR171b 累積，從而負(fù)調(diào)控靶基因HAM 和HAM2，使植株側(cè)根數(shù)量減少，表明其在根發(fā)育中的重要性。MtmiR171b 和MtmiPEP171b1在煙草中的過表達(dá)也具有相似的結(jié)果（Lauresser‐gues et al.，2015）。通過對(duì)MtmiORF171b 和Mtmi‐PEP171b1 以及突變ORF MtmiORF171b 的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，MtmiORF171b 對(duì)MtmiPEP171b1 的翻譯作用增加了Mtmir171b 的積累（Lauressergues et al.，2015）。外施和過表達(dá)MtmiPEP171b1可增加各自pri-miRNAs、pre-miRNAs 和成熟miRNAs 的積累（圖3I）。而用ATT 替代pri-miR171b ORF1 中的ATG 起始密碼子后，仍有少量的miR171b 產(chǎn)生，這表明miPEP171b 充當(dāng)了調(diào)節(jié)介質(zhì)并使相關(guān)的miRNA積累增加（Lauressergues et al.，2015）。

外源miPEPs 如何進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)是限制其在植物中發(fā)揮功能的重要問題。一般認(rèn)為，內(nèi)吞作用和被動(dòng)擴(kuò)散是miPEPs 內(nèi)化的主要途徑（Ormancey et al.，2020）。在用熒光染料標(biāo)記MiPEP165a 對(duì)擬南芥進(jìn)行外源處理后，觀察到miPEP165a 能快速進(jìn)入根冠和分生組織區(qū)，而根部其余部分的滲透延遲（Ormancey et al.，2020）。通過研究進(jìn)入植株體內(nèi)的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)途徑和膜微結(jié)構(gòu)域途徑發(fā)現(xiàn)；miPEP165a在根冠、分生組織和根的分化區(qū)是被動(dòng)進(jìn)入，而在根細(xì)胞成熟區(qū)的進(jìn)入受到影響。其中，rem1-2 在miPEP 吸收中受到強(qiáng)烈影響。進(jìn)一步通過使用化學(xué)抑制劑 TyrA23 和 MβCD 分別抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和膜微域途徑。結(jié)果表明，這些分子阻斷了施用miPEP165a 對(duì)根長的正向表型效應(yīng)。這說明miPEPs 可能具有局部效應(yīng)，而不是系統(tǒng)效應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

雖然許多具有sORF 的RNA 曾經(jīng)被歸類為ncRNA，因而在以往的研究中忽視了對(duì)這些具有潛在翻譯能力的sORF 鑒定，但是越來越多研究結(jié)果表明具有生物活性的非編碼RNA 來源小肽真實(shí)存在并且在生物體內(nèi)發(fā)揮不可替代的功能，使我們重新認(rèn)識(shí)這些非編碼RNA 的功能形式（Lu et al.，2004；Ma et al.，2014；Ma et al.，2016；Olexiouk et al.，2018）。本文總結(jié)了識(shí)別、篩選和鑒定sORF的方法，以及編碼小肽的非編碼RNA 種類，揭示了非編碼RNA 來源小肽在生物體內(nèi)的多重作用機(jī)制與生物功能。這些進(jìn)展揭示了非編碼RNA 來源的小肽具有成為抗腫瘤藥物、治療靶點(diǎn)以及腫瘤生物標(biāo)志物的巨大潛力，例如作為新型抗腫瘤藥物，小肽相比其來源RNA 具有更高的活性，更低的免疫原性和更低的細(xì)胞毒性，因此可以合成腫瘤抑制微肽并直接遞送到癌癥組織（Zhu et al.，2018；Bakhti et al.，2022）。由于小肽易于代謝降解的特點(diǎn)，也使在植物中應(yīng)用外源合成小肽相比使用轉(zhuǎn)基因手段和化學(xué)農(nóng)藥具有更高的安全性，將成為一種新的改善植物農(nóng)藝性狀的手段（Yadav et al.，2021）。這些新發(fā)現(xiàn)使研究者開始重新審視過去的非編碼RNA 研究，是否由于技術(shù)限制了對(duì)其編碼能力的預(yù)測和驗(yàn)證？其編碼小肽是否可能發(fā)揮與母體RNA 相似的功能，甚至其母體RNA“表現(xiàn)”出的功能是否實(shí)際上由其編碼小肽執(zhí)行？分子研究手段的不斷發(fā)展讓小肽的功能與RNA 自身活性得以區(qū)分，也強(qiáng)調(diào)了在未來的非編碼RNA 研究中分離RNA 功能和小肽功能的必要性。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)mRNA 也具有與其編碼蛋白無關(guān)的非編碼功能，例如一種編碼早期減數(shù)分裂誘導(dǎo)蛋白1（Emi1）的mRNA 轉(zhuǎn)錄本，可從其3’UTR 加工成熟一種功能性長非編碼RNA——端粒酶RNA（TER）（Logeswaran et al.，2022）。目前已有定義統(tǒng)一將既能以RNA 形式發(fā)揮功能，又能以蛋白形式發(fā)揮功能 的RNA 稱 為cncRNA （coding and non-coding RNAs），也叫雙功能RNA，包括了具有編碼功能的ncRNA 和具有非編碼功能的mRNA（Kumari et al.，2015）。未來的小肽研究可能會(huì)將更多的非編碼RNA列入雙功能RNA的隊(duì)伍中。

同時(shí)，盡管一些非編碼RNA 來源的小肽的重要功能已經(jīng)被揭示，但是還有許多問題尚未解決。例如，在小肽的篩選和翻譯驗(yàn)證方面，如何進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有檢測技術(shù)減少假陽性，找到更多可翻譯的小肽？決定sORF 成功翻譯小肽的關(guān)鍵因素是什么？是否有特定的上下文序列決定sORF 能否進(jìn)行翻譯？無義介導(dǎo)的mRNA 衰變（NMD，nonsensemediated mRNA decay）作為監(jiān)視機(jī)制可降解錯(cuò)誤的mRNA，并對(duì)虛假翻譯做出反應(yīng)（Lykke-Andersen et al.，2015；Supek et al.，2021）。含 有sORF 的lncRNA 很可能成為NMD 的目標(biāo)，那么NMD 靶向lncRNA 的程度如何？同時(shí)，在對(duì)小肽的功能研究方面，如何系統(tǒng)性大量驗(yàn)證小肽的不同生理功能？如何克服小蛋白的研究障礙（如蛋白豐度低、不穩(wěn)定、缺乏特異性抗體等）？如何改善和優(yōu)化小肽的結(jié)合親和力和長效呈遞能力來實(shí)現(xiàn)小肽在疾病中和植物中的實(shí)際應(yīng)用？因此，未來我們不僅僅需要努力擴(kuò)大和完善小肽檢測技術(shù)，還需要繼續(xù)發(fā)展各種各樣的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證和研究小肽的時(shí)空表達(dá)模式及生物學(xué)功能，豐富和完善小肽在生物體中發(fā)揮功能的各種分子機(jī)制，為利用小肽作為藥物研發(fā)或者農(nóng)作物增產(chǎn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)和實(shí)際應(yīng)用提供新的思路和方向。