紫草烏中生物堿成分及其對H9c2細胞毒性研究

何健民，嚴園鋒，尹田鵬*

紫草烏中生物堿成分及其對H9c2細胞毒性研究

何健民1，嚴園鋒2，尹田鵬2*

(1. 保山學院資源環境學院，云南 保山 678000；2. 遵義醫科大學生物工程學院，廣東 珠海 519041)

為了解我國特有藥用烏頭種紫草烏()的生物堿類化學成分及其對大鼠心臟細胞H9c2的細胞毒性,從紫草烏中分離出10個C19-二萜生物堿，根據理化性質和波譜數據，其結構分別鑒定為滇烏堿(1)、粗莖烏頭堿甲(2)、黃草烏堿丙(3)、黃草烏堿甲(4)、麗烏亭(5)、獵鷹烏頭堿(6)、14--乙酰薩卡可尼亭(7)、薩卡可尼亭(8)、查斯曼寧(9)和展毛黃草烏堿A (10)。化合物5、6和10為首次從該植物中分離得到。化合物1～4、6～7和9～10對大鼠心臟細胞H9c2增殖的半數抑制濃度為163.8～341.6g/mL，表明紫草烏中的生物堿對H9c2細胞具有毒性作用。

紫草烏；烏頭屬；二萜生物堿；核磁共振波譜；毒性；化學成分

毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬()植物是重要的中藥藥源植物。目前《中華人民共和國藥典》[1]正式收錄2種烏頭屬植物：烏頭()和北烏頭()。此外，我國民間至少還有76種烏頭屬植物藥用，如短柄烏頭(A.)、黃花烏頭()、鐵棒錘()、瓜葉烏頭()等[2]。紫草烏()，異名西南烏頭、深裂黃草烏、藤烏, 是我國特有的藥用烏頭種，分布于云南西北部和四川西南部，生長在海拔2 400～3 200 m山地[3]。紫草烏塊根具有罕見的解救其他草烏中毒作用，其以“堵喇”之名在西南地區已有近千年藥用歷史，納西族醫藥古籍《東巴經》、彝族醫藥古籍《造藥治病書》和清代《植物名實圖考》中均有記載，有報道該植物提取物具有一定的抗心律失常作用[4]。

二萜生物堿是烏頭屬植物的特征性有效成分，紫草烏含大量的二萜生物堿類成分[5]。為更好地開發利用我國這一特色藥用烏頭資源，本課題組對云南麗江的紫草烏開展生物堿成分研究，從其根中分離出10個二萜生物堿，此外，鑒于烏頭類藥材的毒性主要表現為心臟毒性，采用CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)法測試部分化合物對小鼠心臟細胞H9c2的毒性，為紫草烏的開發與利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

DRX-500和DRX-600型NMR儀(德國Bruker公司)；G3250AA TOF型MS儀(美國Agilent公司)；UPHW-Ⅱ-90T型超純水機(四川優普超純科技有限公司)；Spectramax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，CB150型CO2培養箱(德國Binder公司)。

DMEM培養基、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(PS) (美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；96孔板、CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)；柱色譜硅膠(300～400目)和GF254型薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠SephadexLH- 20 (美國GE公司)；三氯甲烷、甲醇、石油醚、二乙胺、氨水(分析純，天津化學試劑有限公司); 氘代三氯甲烷(CDCl3) (寧波旋光醫藥科技有限公司); 改良碘化鉍鉀試劑(堿式硝酸鉍0.85 g，加冰醋酸10 mL、水40 mL溶解，再加40%碘化鉀溶液20 mL搖勻，得前液；取前液1 mL，加0.6 mol/L鹽酸2 mL,加水至10 mL即得)。

紫草烏原藥材于2018年11月采于云南省麗江市，經保山學院汪建云教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物紫草烏()的根，標本(2018-ae-1)保存于保山學院。大鼠心肌細胞H9c2購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。

1.2 提取和分離

紫草烏塊根10.0 kg陰干、粉碎后，用0.1 mol/L鹽酸40 L進行滲漉，至滲漉液無生物堿反應。滲轆液以25%氨水調至pH 9，加入乙酸乙酯萃取3次, 每次約20 L。合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得深褐色總生物堿浸膏47.5 g。總生物堿浸膏以硅膠(300～ 400目, 下同)拌樣，進行硅膠柱色譜，以三氯甲烷- 甲醇(50:1→1:1)梯度洗脫。采用薄層色譜法通過改良碘化鉍鉀試劑顯色監測洗脫過程，合并相同組分，結果共獲得8個洗脫組分(Fr.A～Fr.H)。

取Fr.B組分(1.5 g)，經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺，100:20:1)和凝膠柱色譜(甲醇)，得化合物2 (45 mg)和3 (15 mg)。取Fr.C組分(0.5 g)，經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺，100:20:1)和凝膠柱色譜(甲醇)，得化合物1 (24 mg)。取Fr.D組分(2.5 g),依次經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺, 100:20:1)、凝膠柱色譜(甲醇)和硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇, 10:1)，得化合物4 (35 mg)、5 (3 mg)和6 (18 mg)。取Fr.E組分(3.8 g)，經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺，100:20:1)，得化合物7 (230 mg)和8 (4 mg)。取Fr.F組分(1.8 g)，經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺，100:20:1)和凝膠柱色譜(甲醇)，得化合物10 (13 mg)。取Fr.G組分(1.3 g)，經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮-二乙胺，100:20:1)，得化合物9 (186 mg)。

1.3 體外心臟細胞毒性測定方法

參照張麗娟等[6]的方法，大鼠心肌細胞H9c2培養于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM培養液中，待細胞生長到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養后換液，根據細胞狀態及密度定期進行換液或傳代。將對數生長期H9c2細胞計數接種于96孔板中(100L/孔，即5×103cells/孔)，每孔加入完全培養基0.1 mL，于37 ℃、5% CO2培養箱中過夜，棄上清液，考察細胞抑制率，每組平行6次，藥物作用24 h后，每孔加入10% CCK-8溶液20L，在37 ℃培養2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度A450，計算細胞抑制率(I)。空白組細胞抑制率為0，I=(1-實驗組A450/對照組A450)×100%。采用統計學軟件GraphPad Prism 5.0 (GraphPadSoftware Inc., USA)中的Tukey對細胞抑制率進行單因子方差分析(One-Way ANOVA)，實驗重復3次。

1.4 結構鑒定

化合物1 白色針晶；分子式C35H49NO11, ESI-MS: 660.34 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H7.99 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′/H-5′), 4.86 (1H, d,= 5.2 Hz, H-14), 4.01 (1H, d,= 6.6 Hz, H-6), 3.86 (3H, s, OCH3-4′), 3.53, 3.29, 3.25, 3.15 (各3H, s, OCH3×4), 3.76 (1H, dd,= 9.6 Hz, 7.6 Hz, H-3), 3.62, 3.48 (各1H, ABq,= 9.0 Hz, H-18), 3.38 (1H, dd,= 8.8, 5.8 Hz, H-16), 3.11 (1H, dd,= 8.2, 6.0 Hz, H-1), 3.00 (1H, brs, H-7), 2.86 (1H, brs, H-17), 1.33 (3H, s, OCOCH3-8), 1.09 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C82.3 (C-1), 33.7 (C-2), 71.6 (C-3), 43.3 (C-4), 47.5 (C-5), 83.2 (C-6), 48.8 (C-7), 85.6 (C-8), 44.8 (C-9), 40.9 (C-10), 50.3 (C-11), 35.3 (C-12), 74.8 (C-13), 78.6 (C-14), 39.7 (C-15), 83.6 (C-16), 61.8 (C-17), 77.2 (C-18), 48.9 (C-19), 47.5 (C-21), 13.4 (C-22), 55.9 (OCH3-1), 57.9 (OCH3- 6), 58.9 (OCH3-16), 59.2 (OCH3-18), 21.7 (OCOCH3- 8), 170.0 (OCOCH3-8), 166.1 (OCO-14), 122.6 (C-1′), 131.8 (C-2′/C-6′), 113.9 (C-3′/C-5′), 163.5 (C-4′), 55.5 (OCH3-4′)。以上數據與文獻[7]報道一致, 故鑒定為滇烏堿。

化合物2 白色粉末; 分子式C35H49NO10, ESI-MS: 644.34 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H8.00 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′/H-5′), 4.86 (1H, d,= 5.1 Hz, H-14), 3.86 (3H, s, OCH3-4′), 3.51, 3.27, 3.25, 3.14 (各3H, s, OCH3×4), 3.95 (1H, d,= 6.8 Hz, H-6), 3.59, 3.17 (各1H, ABq,= 8.6 Hz, H-18), 3.37 (1H, dd,= 9.0, 5.6 Hz, H-16), 3.01 (1H, m, H-1), 2.99 (1H, brs, H-17), 1.32 (3H, s, OCOCH3-8), 1.08 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C83.8 (C-1), 26.4 (C-2), 35.0 (C-3), 39.4 (C-4), 49.2 (C-5), 83.1 (C-6), 45.2 (C-7), 85.7 (C-8), 49.6 (C-9), 41.1 (C-10), 50.3 (C-11), 35.9 (C-12), 75.0 (C-13), 78.6 (C-14), 39.4 (C-15), 85.1 (C-16), 62.2 (C-17), 80.5 (C-18), 53.7 (C-19), 49.3 (C-21), 13.6 (C-22), 56.3 (OCH3-1), 57.9 (OCH3-6), 58.8 (OCH3-16), 59.4 (OCH3-18), 21.8 (OCOCH3-8), 170.0 (OCOCH3-8), 166.2 (OCO-14), 122.8 (C-1′), 131.8 (C-2′/C-6′), 113.8 (C-3′/C-5′), 163.5 (C-4′), 55.5 (OCH3-4′)。以上數據與文獻[8]報道一致, 故鑒定為粗莖烏頭堿甲。

化合物3 白色粉末; 分子式C35H49NO9, ESI-MS: 628.35 [M + H]+;1H NMR (600 MHz, CDCl3):H8.00 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′/H-5′), 5.02 (1H, t,= 4.8 Hz, H-14), 3.85 (3H, s, OCH3-4′), 3.37, 3.27, 3.26, 3.17 (各3H, s, OCH3×4), 4.05 (1H, d,= 6.5 Hz, H-6), 3.62, 3.22 (各1H, ABq,= 8.4 Hz, H-18), 3.32 (1H, m, H-16), 3.04 (1H, m, H-1), 2.99 (1H, brs, H-17), 1.38 (3H, s, OCOCH3-8), 1.07 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C85.2 (C-1), 26.6 (C-2), 35.0 (C-3), 39.3 (C-4), 49.5 (C-5), 83.0 (C-6), 45.1 (C-7), 86.0 (C-8), 49.3 (C-9), 44.1 (C-10), 50.5 (C-11), 29.1 (C-12), 39.3 (C-13), 75.5 (C-14), 38.0 (C-15), 83.6 (C-16), 61.8 (C-17), 80.6 (C-18), 53.9 (C-19), 49.2 (C-21), 13.6 (C-22), 56.2 (OCH3-1), 58.0 (OCH3-6), 56.7 (OCH3-16), 59.3 (OCH3-18), 21.9 (OCOCH3-8), 169.9 (OCOCH3-8), 166.7 (OCO-14), 123.1 (C-1′), 131.9 (C-2′/C-6′), 113.9 (C-3′/C-5′), 163.4 (C-4′), 55.6 (OCH3-4′)。以上數據與文獻[9]報道一致, 故鑒定為黃草烏堿丙。

化合物4 淡黃色粉末; 分子式C35H49NO10, ESI-MS: 644.34 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H7.98 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′/H-6′), 6.89 (1H, d,= 8.5 Hz, H-3′/H-5′), 5.01 (1H, t,= 5.0 Hz, H-14), 4.09 (1H, d,= 6.5 Hz, H-6), 3.61, 3.46 (各1H, ABq,= 9.0 Hz, H-18), 3.34, 3.30, 3.27, 3.23 (各3H, s, OCH3×4), 3.83 (3H, s, OCH3-3′), 1.38 (3H, s, OCOCH3-8), 1.07 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C83.9 (C-1), 33.7 (C-2), 72.1 (C-3), 43.5 (C-4), 47.2 (C-5), 82.7 (C-6), 45.2 (C-7), 86.2 (C-8), 49.1 (C-9), 43.5 (C-10), 50.8 (C-11), 28.8 (C-12), 39.6 (C-13), 75.7 (C-14), 38.5 (C-15), 83.1 (C-16), 61.8 (C-17), 77.5(C-18), 49.1 (C-19), 48.0 (C-21), 13.6 (C-22), 170.2 (OCOCH3-8), 22.1 (OCOCH3-8), 55.8 (OCH3-1), 57.0 (OCH3-6), 56.0 (OCH3-16), 59.5 (OCH3-18), 166.4 (OCO-14), 123.2 (C-1′), 132.1 (C-2′/C-6′)), 114.1 (C-3′/C-5′), 163.8 (C-4′), 55.8 (OCH3-3′)。以上數據與文獻[5]報道一致, 故鑒定為黃草烏堿甲。

化合物5 白色粉末; 分子式C33H47NO9, ESI-MS: 602.33 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H7.95 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, d,= 9.0 Hz, H-3′/H-5′), 5.12 (1H, d,= 5.0 Hz, H-14), 4.01 (1H, d,= 5.4 Hz, H-6), 3.83 (3H, s, OCH3-4′), 3.35, 3.27, 3.25, 3.23 (各3H, s, OCH3×4), 3.62, 2.60 (1H, ABq,= 9.0 Hz, H-18), 3.30 (1H, m, H-16), 3.11 (1H, dd,= 10.3, 6.3 Hz, H-1), 3.05 (1H, brs, H-7), 1.07 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C85.6 (C-1), 26.3 (C-2), 35.2 (C-3), 39.5 (C-4), 49.9 (C-5), 82.7 (C-6), 48.6 (C-7), 73.9 (C-8), 53.7 (C-9), 42.5 (C-10), 50.4 (C-11), 36.7 (C-12), 76.4 (C-13), 80.3 (C-14), 42.0 (C-15), 83.5 (C-16), 62.4 (C-17), 80.8 (C-18), 53.9 (C-19), 49.4 (C-21), 13.8 (C-22), 56.5 (OCH3-1), 58.4 (OCH3- 6), 57.7 (OCH3-16), 59.4 (OCH3-18), 166.8 (OCO-14), 122.6 (C-1′), 132.0 (C-2′/C-6′), 114.0 (C-3′/C-5′), 163.7 (C-4′), 55.6 (OCH3-4′)。以上數據與文獻[10]報道一致, 故鑒定為麗烏亭。

化合物6 白色粉末; 分子式C33H47NO9, ESI-MS: 602.33 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H7.62 (1H, dd,= 8.8, 2.0 Hz, H-6′), 7.56 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.87 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 5.14 (1H, t,= 5.0 Hz, H-14), 4.11 (1H, d,= 6.8 Hz, H-6), 3.91, 3.90 (各3H, s, OCH3-3′, OCH3-4′), 3.29, 3.28, 3.25, 3.19 (各3H, s, OCH3×4), 3.68, 2.59 (各1H, ABq,= 8.6 Hz, H-18), 3.04 (1H, dd,= 10.2,6.4 Hz, H-1), 2.94 (1H, brs, H-7), 1.07 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C85.6 (C-1), 26.4 (C-2), 35.0(C-3), 39.3 (C-4), 47.0 (C-5), 82.0 (C-6), 53.9 (C-7), 74.0 (C-8), 49.7 (C-9), 45.3 (C-10), 50.4 (C-11), 29.3 (C-12), 37.2 (C-13), 76.9 (C-14), 41.6 (C-15), 82.9 (C-16), 62.0 (C-17), 80.8 (C-18), 54.1 (C-19), 49.2 (C-21), 13.7 (C-22), 56.2 (OCH3-1), 57.8 (OCH3-6), 56.3 (OCH3-16), 59.3 (OCH3-18), 166.2 (OCO-14), 123.0 (C-1′), 110.5 (C- 2′), 148.8 (C-3′), 153.0 (C-4′), 112.2 (C-5′), 123.6 (C-6′), 56.0 (OCH3-3′), 56.1 (OCH3-4′)。以上數據與文獻[11]報道一致, 故鑒定為獵鷹烏頭堿。

化合物7 無色針晶; 分子式C25H39NO5, ESI-MS: 434.29 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CDCl3):H4.81 (1H, t,= 5.0 Hz, H-14), 2.04 (3H, s, OCOCH3-14), 3.26, 3.21 (各3H, s, OCH3×2), 3.10 (1H, dd,= 10.8, 6.6 Hz, H-1), 3.18 (1H, dd,= 9.4, 4.2 Hz, H-1), 2.95 (1H, brs, H-7), 0.76 (3H, s, CH3- 18), 1.04 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C86.2 (C-1), 26.5 (C-2), 38.0 (C-3), 34.6 (C-4), 50.9 (C-5), 25.5 (C-6), 46.3 (C-7), 74.0 (C-8), 45.5 (C-9), 45.0 (C-10), 49.1 (C-11), 28.7 (C-12), 35.7 (C-13), 77.2 (C-14), 41.2 (C-15), 81.9 (C-16), 62.0 (C-17), 26.5 (C-18), 56.3 (C-19), 49.5 (C-21), 13.7 (C-22), 56.3 (OCH3-1), 56.4 (OCH3-16), 170.9 (OCOCH3-14), 21.5 (OCOCH3-14)。以上數據與文獻[5]報道一致, 故鑒定為14--乙酰薩卡可尼亭。

化合物8 白色粉末; 分子式C23H37NO4, ESI-MS: 392.28 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H4.81 (1H, d,= 4.3 Hz, OH-14), 4.12 (1H, dd,= 9.5, 4.8 Hz, H-14), 3.41 (1H, m, H-16), 3.08 (1H, dd,= 10.9, 6.5 Hz, H-1), 3.36, 3.25 (各3H, s, OCH3×2), 3.12 (1H, brs, H-7), 3.08, 2.98 (各1H, ABq,= 9.0 Hz, H-18), 1.04 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C86.8 (C-1), 26.5 (C- 2), 38.1 (C-3), 37.8 (C-4), 51.0 (C-5), 25.3 (C-6), 45.9 (C-7), 73.1 (C-8), 47.2 (C-9), 37.7 (C-10), 49.1 (C-11), 27.9 (C-12), 47.2 (C-13), 75.8 (C-14), 38.6 (C-15), 82.4 (C-16), 62.7 (C-17), 26.4 (C-18), 57.0 (C-19), 49.6 (C-21), 13.9 (C-22), 56.5 (OCH3-1), 56.6 (OCH3- 16)。以上數據與文獻[12]報道一致, 故鑒定為薩卡可尼亭。

化合物9 白色針晶；分子式C25H41NO6, ESI-MS: 452.29 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H4.56 (1H, d,= 4.2 Hz, OH-14), 4.19 (1H, d,= 6.9 Hz, H-6), 4.09 (1H, dd,= 9.8, 4.9 Hz, H- 14), 3.39 (1H, m, H-16), 2.98 (1H, dd,= 10.7, 6.5 Hz, H-1), 3.33, 3.01, 3.29, 3.23 (各3H, s, OCH3×4), 3.12 (1H, brs, H-7), 3.71, 2.63 (各1H, ABq,= 8.5 Hz, H-18), 1.06 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C86.4 (C-1), 26.1 (C-2), 35.4 (C-3), 39.6 (C-4), 48.8 (C-5), 82.5 (C-6), 52.7 (C-7), 72.7 (C-8), 50.5 (C-9), 45.7 (C-10), 50.4 (C-11), 28.5 (C-12), 38.0 (C-13), 75.7 (C-14), 38.9 (C-15), 82.2 (C-16), 62.8 (C-17), 80.9 (C-18), 53.9 (C-19), 49.5 (C-21), 13.9 (C-22), 56.4 (OCH3-1), 57.5 (OCH3- 6), 56.6 (OCH3-16), 59.4 (OCH3-18)。以上數據與文獻[11]報道一致, 故鑒定為查斯曼寧。

化合物10 白色粉末；分子式C23H35NO3, ESI-MS: 374.27 [M + H]+;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H5.30 (1H, d,= 5.2 Hz, H-7), 3.39 (1H, m, H-16), 3.31, 3.15 (各3H, s, OCH3×2), 0.72 (3H, s,= 8.5 Hz, H-18), 0.96 (3H, t,= 7.2 Hz, NCH2CH3)；13C NMR (150 MHz, CDCl3)：C85.2 (C-1), 26.4 (C-2), 39.2 (C-3), 33.5 (C-4), 41.6 (C-5), 22.8 (C-6), 119.3 (C-7), 137.4 (C-8), 46.9 (C-9), 48.5 (C-10), 41.3 (C- 11), 36.5(C-12), 48.9 (C-13), 218.6 (C-14), 37.5 (C- 15), 80.1 (C-16), 49.9 (C-17), 26.1 (C-18), 58.1 (C- 19), 52.7 (C-21), 12.7 (C-22), 54.9 (OCH3-1), 56.1 (OCH3-16)。以上數據與文獻[13]報道一致, 故鑒定為展毛黃草烏堿A。

1.5 體外心臟細胞毒性初步評價

結果表明，測試的紫草烏根中二萜生物堿均對H9c2細胞增殖有抑制作用。與空白對照相比，二萜生物堿對H9c2細胞增殖的抑制率隨濃度增加而升高，且差異達顯著水平(<0.05)。從表1可見, 250g/mL二萜生物堿的抑制率為32.12%～70.33%，半數抑制濃度(IC50)為163.8～341.6g/mL。其中雙酯類化合物(C-8和C-14均取代有酯基，如化合物1～4)表現出較高的H9c2細胞毒性(IC50<250g/mL)，而單酯類(如化合物7)和醇胺類成分(化合物9和10)則表現出相對低的H9c2細胞毒性。此外，總生物堿對H9c2的細胞毒性比單體化合物低(IC50=442.4g/mL)。

表1 部分化合物對H9c2增殖的抑制毒性

*:<0.05;=6

2 結果和討論

本研究從云南的紫草烏中分離鑒定了10個烏頭堿型C19-二萜生物堿類化合物，分別為滇烏堿(1)、粗莖烏頭堿甲(2)、黃草烏堿丙(3)、黃草烏堿甲(4)、麗烏亭(5)、獵鷹烏頭堿(6)、14--乙酰薩卡可尼亭(7)、薩卡可尼亭 (8)、查斯曼寧(9)和展毛黃草烏堿A (10)，其中化合物5、6和10為首次從該植物中分離得到。C19-烏頭堿型二萜生物堿為紫草烏的主要化學成分[5,14–15]。紫草烏中的C19-二萜生物堿包括雙酯類(化合物1～4)、單酯類(化合物5～ 7)和醇胺類生物堿(化合物8～10)，其中單酯堿和醇胺堿的含量高于雙酯堿。

細胞毒性結果表明，雙酯型C19-二萜生物堿的心臟細胞毒性高于單酯型和醇胺型。動物藥理研究也已證實，雙酯類C19-烏頭堿型二萜生物堿具有極強的毒性，但隨著C-8位酯基和C-14位芳香酯基的先后水解，形成單酯類和醇胺類生物堿則毒性大為降低，并可表現出一定的抗心律失常作用[16–17]。單酯類和醇胺類C19-烏頭堿或為紫草烏抗心律失常作用的有效成分，是其發揮解救其他烏頭中毒的藥效物質。此外，紫草烏總生物堿對H9c2毒性比單體化合物低，或源于組分間相互作用的結果，提示總生物堿中存在具有拮抗心臟毒性的成分，這與烏頭類藥材如附子兼具致心律失常與抗心律失常作用的表現一致[16]。

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Alkaloidal Constituents ofand Their Toxicity on H9c2 Cells

HE Jianmin1, YAN Yuanfeng2, YIN Tianpeng2*

(1. School of Resource and Environment, Baoshan University, Baoshan 678000, Yunnan, China；2. School of Bioengineering,Zunyi Medical University,Zhuhai 519041, Guangdong, China)

To understand the alkaloidal constituents of, anspecies endemic to China, and their toxicity against rat cardiomyocyte H9c2 cells, ten diterpenoid alkaloids were extracted fromroots. Based on physical and chemical properties and spectral data, their structures were identified as yunaconitine (1), crassicauline A (2), vilmorrianine C (3), vilmorrianine A (4), forestine (5), falconeridine (6), 14-- acetylsachaconitine (7),sachaconitine (8),chasmanine (9) and vilmotenitine A (10), were isolated and identified fromroots. Compounds 5, 6 and 10 were isolated from this species for the first time.The median inhibition concentrations of compounds 1-4, 6-7 and 9-10 on H9c2 cells ranged from 163.8 to 341.6g/mL, showing the alkaloids inhad toxic effects on H9c2 cells.

;; Diterpenoid alkaloid; NMR; Toxicity; Chemical constituent

10.11926/jtsb.4616

2022-01-21

2022-02-14

國家自然科學基金項目(31860095)；云南省地方本科高校基礎研究聯合專項項目(2018FH001-126)；貴州省科技計劃項目(黔科合基礎[2018]1193)；貴州省中醫藥管理局中醫藥、民族醫藥科學技術研究課題(QZYY-2022-020)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31860095), the Joint Special Project for Basic Research of Local Universities in Yunnan (Grant No. 2018FH001-126), the Project for Science and Technology in Guizhou (Grant No. [2018]1193), and the Project for Science and Technology Research of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine in Guizhou (Grant No. QZYY-2022-020).

何健民(1983年生)，男，副教授，主要從事天然產物化學研究。E-mail: 420787946@qq.com

. E-mail: ytp@zmu.edu.cn