酵母菌發酵制備明日葉酵素的工藝優化

付坤麗，華璞玥，李子超*，劉 峰

（1.青島大學生命科學學院食品科學與工程系，山東青島 266000；2.寧波城市職業技術學院景觀生態學院，浙江寧波 315000）

明日葉（Angelica keiskei）是一種傘形科多年生食藥兼用的優良珍貴草本植物，生長速度快，前一天摘葉，次日便會生出新葉，因此得名“明日葉”，已于2019 年經國家衛生健康委員會委審核正式成為我國新食品原料成員之一[1-2]。明日葉原產于日本太平洋沿岸八丈、伊豆等島嶼，主要分布在中國、日本、韓國、印度等亞洲國家，目前在我國山東、江蘇、云南、廣西、臺灣等多地已有種植[3-4]。據報道，明日葉中不僅含有人體所必需的維生素、礦物質、氨基酸等營養素，并且富含類黃酮、香豆素、多糖等活性物質[5-6]，具有抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂、保護肝臟、抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性[7-9]，且無毒副作用[10-12]，日益受到人們的關注。明日葉的地上部分主要用作日常保健食品綠色蔬菜汁的來源，如嫩葉可用于煮沸或油炸，也可用于制作茶、面粉、酒和化妝品等產品[13-14]。然而，目前國內市場上的明日葉產品多為茶、粉、饅頭、面條等初級加工產品，生物利用率低，亟待開發高附加值的精細加工產品。

酵素是以動物、植物、菌類等為原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分的產品[15]。研究發現，酵素具有促進人體新陳代謝、促進血液循環、保護腸道、調節人體酸堿平衡、抗氧化及抗疲勞等作用[16]。植物原料經過酵母菌、乳酸菌等益生菌發酵后，不僅能夠改變原料本身的風味，還能通過復雜多變的生化反應，提高活性成分含量，增加酵素產品的功能性，并且可以延長易腐原料的保質期、改善蛋白質和碳水化合物的消化性[17]。因此，植物酵素市場的發展潛力巨大，開發及應用前景十分廣闊。

本研究以明日葉凍干粉為試驗原料，酵母菌為發酵菌種，以總黃酮含量和γ-氨基丁酸含量為主要指標，結合查爾酮含量、總酚含量、游離氨基酸含量、蛋白質含量以及感官評分等其他指標，明確了明日葉酵素的最佳發酵工藝，以制備出具有優良品質的明日葉酵素飲品，為明日葉的深度開發、高值化利用提供新的思路和研究依據，提高明日葉的經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明日葉凍干粉，山東明日葉生物科技有限公司；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；蘆丁標準品（純度98%，CAS 號：153-18-4），合肥博美生物科技有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標準品（純度99%，CAS 號:56-12-2），酷爾化學科技（北京）有限公司；沒食子酸標準品（純度95.4%，CAS 號:149-91-7），壇墨質檢-標準物質中心；查爾酮標準品（純度98%，CAS 號：487-52-5），壇墨質檢-標準物質中心；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、四硼酸鈉、苯酚試劑、磷酸二氫鈉、苯駢戊三酮（茚三酮）、葡萄糖、苯酚、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；次氯酸鈉、3,5-二硝基水楊酸，化學純，國藥集團化學試劑有限公司；L-白氨酸、牛白蛋白、福林酚試劑均為生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津市河東區紅巖試劑廠；無水碳酸鈉，分析純，天津市北辰方正試劑廠；氫氧化鈉，分析純，天津市優譜化學試劑有限公司；雙縮脲試劑（AB液），優級純GR，飛凈生物科技有限公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3E 酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；食品糖度計BK-506，上海勃基儀器儀表有限公司；UV-8000 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養箱、LTN2-16K 臺式高速離心機、HH-6 數顯恒溫水浴鍋，青島藍特恩儀器設備有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺，上海滬凈醫療器械有限公司；Vortex-2 漩渦混勻儀，上海滬析實業有限公司；GL124-1SCN 分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-50SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 明日葉酵素的制備

將高活性干酵母與無菌水按照1∶10（g/mL）的比例混合溶解，置于恒溫磁力攪拌器中37 ℃活化30 min，備用[18]。準確稱取一定質量的明日葉凍干粉，加入盛有200mL無菌水的燒杯中混勻，無菌條件下，接種活化后的酵母菌液于37 ℃恒溫條件下靜置發酵，發酵結束后取上清液，12000 r/min 離心4 min，所得液體即明日葉酵素。

1.3.2 單因素試驗

（1）酵母菌接種量的確定

明日葉凍干粉添加量15 g，發酵時間72 h，其他發酵條件同1.3.1，設置酵母菌接種量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，制備明日葉酵素。待發酵完成后測量發酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量。本實驗采用以總黃酮為主要指標，γ-氨基丁酸為次要指標進行綜合評價。重復3次試驗，取平均值。

（2）明日葉凍干粉添加量的確定

酵母菌接種量1.5%，發酵時間72 h，設置明日葉凍干粉添加量為10、12.5、15、17.5、20 g，制備明日葉酵素。其他同1.3.2（1）。

（3）發酵時間的確定

酵母菌接種量1.5%，明日葉凍干粉添加量15 g，設置發酵時間為24、48、72、96、120 h，制備明日葉酵素。其他同1.3.2（1）。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，運用Box-Behnken 中心組合試驗設計，以酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發酵時間（C）為自變量，運用隸屬度的綜合評分法綜合得分為響應值[19]，設計三因素三水平響應面試驗，利用Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

運用隸屬度的綜合評分法和加權計算，以發酵液中總黃酮含量（F）與γ-氨基丁酸含量（G）對明日葉酵素制備工藝進行綜合評分。兩項指標的隸屬度（I）按公式（1）計算，最終綜合得分（Y）按公式（2）計算。

式中，l為隸屬度；c為指標值；cmax為指標最大值；cmin為指標最小值。

式中，lF為總黃酮含量隸屬度；lG為γ-氨基丁酸含量隸屬度；a、b 為指標權重，本課題以總黃酮含量為主要指標，γ-氨基丁酸含量為次要指標，故取a=0.7，b=0.3。

1.3.4 理化指標測定與感官評價

（1）總黃酮含量

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法[20]。

（2）γ-氨基丁酸含量

采用比色法[21-22]測定。

（3）其他特性

游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定[23]；蛋白質含量采用雙縮脲法測定[24]；總酚含量采用福林酚法測定[25-26]；查爾酮含量采用甲醇法測定[27-28]；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[29]；pH 值采用酸度計直接測定；可溶性固形物含量采用手持式食品糖度計直接測定。

（4）感官評價

感官評價參考文獻[30-31]。感官評價小組由10 人組成，對明日葉酵素的氣味、組織狀態、色澤、口感、滋味五個方面進行觀察、嗅聞和品嘗后，根據表2 的感官評價標準進行綜合打分，結果取平均值。

表2 明日葉酵素的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of A.keiskei Jiaosu

1.4 數據處理

每次試驗均進行三次重復操作，采用SPSS 26、Design-Expert 8.0.6 和Origin Pro 2019 等軟件進行數據的統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 酵母菌接種量對發酵的影響

總黃酮含量和γ-氨基丁酸含量是衡量發酵體系優劣的重要指標[32]。由圖1 可知，發酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量隨著酵母菌接種量的增加呈先增加而后緩慢減少的趨勢。當接種量為1.5%時，總黃酮含量達到最大值，為1.28 g/L；在接種量為2.0%時，γ-氨基丁酸含量達到最大值，為8.10 g/L。在達到最高點后，二者含量均隨酵母菌接種量的增加而減少，可能是由于接種量過大導致酵母數量增長過快，發生自溶，同時微生物的代謝過程消耗營養物質過多，從而不利于發酵產物的積累。故選用1.0%～2.0%的酵母菌接種量作為后續優化條件。

圖1 酵母菌接種量對發酵的影響Fig.1 Effects of inoculation quantity on fermentation

2.1.2 明日葉凍干粉添加量對發酵的影響

由圖2 可知，隨著明日葉凍干粉添加量的增加，發酵液中總黃酮含量呈先快速增加后緩慢增加的趨勢，γ-氨基丁酸含量的變化呈先增加后減少的趨勢。當明日葉凍干粉添加量超過15.0 g 后，因發酵體系中酵母菌不能充分利用發酵液中豐富的營養物質，從而使發酵速度減緩，但明日葉凍干粉本身含有較多黃酮類物質，故在添加量超過15.0 g 后總黃酮含量并未明顯降低而表現為緩慢增長，當添加量為20.0 g 時總黃酮含量達到最大值，為1.33 g/L；γ-氨基丁酸含量隨著明日葉凍干粉添加量的變化先增后減，當添加量為17.5 g 時，γ-氨基丁酸含量達到最大值，為7.49 g/L，過量的明日葉凍干粉可能會導致發酵液濃度過高，從而不利于酵母菌的生長與代謝，導致添加量超過17.5 g 之后γ-氨基丁酸含量開始下降。因此后續試驗中明日葉凍干粉添加量選擇在15.0～20.0g之間為宜。

圖2 明日葉凍干粉添加量對發酵的影響Fig.2 Effect of A.keiskei freeze-dried powder addition on fermentation

2.1.3 發酵時間對發酵的影響

由圖3 可知，發酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量隨著發酵時間的變化均呈先增加后減少的趨勢。當發酵時間為96 h 時，總黃酮與γ-氨基丁酸含量均達到最大值，分別為1.46、7.59 g/L。在發酵的初始階段，酵母菌通過破壞植物細胞結構、水解有機物以及釋放酶類物質等途徑將原料中的黃酮類物質釋放出來，同時通過代謝不斷產生γ-氨基丁酸并進行累積。在發酵時間達到96 h 后，隨著發酵時間的延長，發酵體系內微生物數量過多，營養物質通過微生物的呼吸作用被利用，消耗大于生成，加之氧化作用[33]等因素，導致黃酮類物質和γ-氨基丁酸含量下降。故選用72～120h 的發酵時間作為后續優化條件。

圖3 發酵時間對發酵的影響Fig.3 Effects of fermentation time on fermentation

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析

通過單因素試驗確定試驗條件的范圍，以總黃酮與γ-氨基丁酸含量的綜合評分作為響應值（Y），酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發酵時間（C）為自變量優化發酵工藝，結果見表3。通過Design Expert 8.0.6 軟件分析，建立模型，并得到二次回歸方程：Y=0.95+0.014A-0.00505B+0.019C+0.061AB-0.022AC-0.016 BC-0.098A2-0.074B2-0.088C2。

表3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 Response surface experiment design and results

2.2.2 方差分析

對得到的回歸模型進行方差分析，結果如表4 所示。由表4 可知，該回歸模型P＜0.0001，達到了極顯著水平，失擬項（P=0.0519＞0.05）不顯著，且R2=0.9912 表明該模型可接受，具有較高的擬合度，可利用該模型評價上述變量參數對于明日葉酵素總黃酮與γ-氨基丁酸含量綜合得分的影響。由表中P值可知，模型中因子C、AB、A2、B2、C2對明日葉酵素綜合得分影響極顯著（P＜0.01），因子A、AC、BC 對明日葉酵素綜合得分影響顯著（P＜0.05）。表明各因素對綜合得分的影響為非線性關系。根據F值大小，可以判斷出各試驗因素對酵母菌制備明日葉酵素的工藝影響由大到小依次為發酵時間（C）、酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

2.2.3 響應面交互作用分析與優化

圖4 是酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發酵時間（C）三變量之間對綜合評分的響應面分析圖。由圖4A 可知，在發酵時間取零水平時，當明日葉凍干粉添加量固定，綜合得分隨著酵母菌接種量的增加先升高而后降低；當酵母菌接種量固定，綜合得分隨著明日葉凍干粉添加量的增加先升高后快速下降，且坡度較陡、等高線為橢圓形，表明酵母菌接種量與明日葉凍干粉添加量的交互作用極顯著。同理，由圖4B、4C 可知，酵母菌接種量與發酵時間、明日葉凍干粉添加量與發酵時間的交互作用對明日葉酵素的綜合得分影響顯著。

圖4 各因素間的交互作用Fig.4 Interaction between the setting factors

2.2.4 最優發酵工藝條件確定及驗證性試驗

通過響應面分析得到酵母菌發酵制備明日葉酵素的最佳工藝條件為酵母菌接種量為1.528%、明日葉凍干粉添加量為17.4400 g、發酵時間為98.5000 h，此條件下明日葉酵素綜合得分預測值為0.9480。根據實際生產的可行性，將工藝條件修正為酵母菌接種量1.5%、明日葉凍干粉添加量17 g、發酵時間98 h。利用此條件，進行3次平行發酵試驗進行驗證，得到綜合得分的平均值為（0.9470±0.0097）分，與預測值誤差1.0260%，在允許范圍內，說明該模型擬合度較高，能夠有效預測明日葉酵素的發酵工藝。

2.3 酵母菌制備明日葉酵素的理化特性及感官評分

根據得到的最佳工藝條件，測定對照組（未接菌）和最佳發酵工藝條件下所得的明日葉酵素的理化特性和感官評分，對進一步驗證最佳發酵工藝的優劣極其必要。由表5 可知，與對照組（未接菌）相比，經過最佳發酵工藝后得到的明日葉酵素的總黃酮含量、γ-氨基丁酸含量、查爾酮含量、總酚含量、游離氨基酸含量、蛋白質含量和感官評分都顯著高于對照組（未接菌）（P＜0.05），這說明結合微生物的發酵作用對制備明日葉酵素具有積極作用，可能是因為酵母菌在發酵期間不斷分泌蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等功能酶，通過酶的協同作用將植物細胞中不易被消化的大分子多糖、蛋白質以及脂類等物質分解成易被吸收的小分子物質[34]。發酵液中微生物活動還可以破壞植物細胞，加速細胞中酚類、黃酮類等物質溶出，增加產量。游離氨基酸代謝產生酸、醇、醛、酯等氣味化合物，其含量對發酵產物的風味品質具有重要影響[35]。本發酵體系中，通過最優工藝發酵，游離氨基酸含量提高了約20 倍，感官評分從76.8 提高到81.4，發酵產物酸甜適宜，口感柔順，具有明日葉特有的清香，風味良好。其pH 值有所升高，可能是發酵過程中消耗了酸類物質所致。上述結果表明本試驗制備的明日葉酵素不僅具有較高的營養價值，還含有豐富的活性物質，有望開發成為功能性食品類產品。

表5 對照組與最佳發酵工藝所得明日葉酵素的理化特性和感官評分Table 5 Physicochemical properties and sensory scores of A. keiskei Jiaosu obtained from the control group and the optimal fermentation process

3 結論

本研究以明日葉凍干粉為原料，通過單因素及響應面優化試驗，得到酵母菌制備明日葉酵素的最優發酵工藝條件：酵母菌接種量為1.528%、明日葉凍干粉添加量為17.44 g、發酵時間為98.5 h。其中在響應面設計及分析中，得到各試驗因素對酵母菌制備明日葉酵素的工藝影響程度由高到低依次為發酵時間、酵母菌接種量、明日葉凍干粉添加量。根據實際生產需要，將工藝條件修正為酵母菌接種量1.5%、明日葉凍干粉添加量17 g、發酵時間98h。本試驗選出的最佳發酵條件與已有報道相符[36]。在此條件下得到的明日葉酵素的綜合評分為0.9470 分（滿分為1），與模型預測值相近。然后進一步通過比較對照組與最佳工藝條件制備的明日葉酵素，得到了總黃酮含量為1.40 g/L、γ-氨基丁酸含量為8.46 g/L、查爾酮含量為0.05 g/L、總酚含量為0.07 g/L、游離氨基酸含量為10.96 g/L、蛋白質含量為4.11 g/L、pH 5.44、可溶性固形物3.63%、感官評分81.4 分的明日葉酵素，驗證了此最優發酵條件能得到品質優良的明日葉酵素產品，符合國家行業標準及市場要求，為實際生產提供理論依據，具有廣闊的發展前景。