基于“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”假說的創新性研究*

侯俊林，周正，劉永，李寧，詹向紅**

（1.河南中醫藥大學 鄭州 450046；2.河南財經政法大學 鄭州 450046；3.河南省中西醫結合防治腦認知疾病工程技術研究中心 鄭州 450046；4.鄭州市中西醫結合防治腦認知疾病重點實驗室 鄭州 450046）

腦老化過速的成因、機制、客觀診斷指標及有效干預策略已成為衰老研究的關鍵科學問題。研究發現長期情志不暢是多種疾病的誘因[1]，但其對腦老化過速的影響及機制尚待闡明。中醫藥在腦老化疾病的防治中頗具優勢，但既往研究多從脾腎入手，聚焦于既成的疾病，對主疏泄調暢情志的肝關注不夠，對未病狀態下肝藏象生理及個體差異鮮有論及，未見從肝論治腦老化過速疾病的策略和措施，缺乏診斷長期肝氣郁結輕度認知功能障礙（Mild Cognitive Impairment，MCI）患者的客觀指標。針對上述問題，詹向紅課題組在多項國家級課題的支持下，加強了肝疏泄功能與腦老化關系的研究，提出“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”假說，并圍繞該假說開展了一系列創新性研究，下文予以總結，以期為從情志角度預防和治療腦老化過速相關疾病提供參考。

1 優化長期負性情緒應激大鼠模型，創制憤怒情緒誘發影片

1.1 首創間接電擊法構建大鼠長期憤怒情緒應激模型

憤怒是負性情緒的核心，長期憤怒情緒積累會對個體及社會造成嚴重危害[2]。長期憤怒應激動物模型的建立是動物情緒及人類情緒相關疾病研究的重點和難點之一。傳統的直接電擊法[3]存在軀體應激較多、不宜持續使用因而不利于誘發長期憤怒情緒等缺點，尚未得到業界一致認可。鑒此，課題組擯棄了對模型組大鼠的直接刺激，創立了一種新型的間接電擊法：使用小動物電刺激器，首先把單只模型組大鼠放入打斗籠內，再隨機放進一只攻擊鼠，用電擊激惹攻擊鼠，使其對模型組大鼠發起攻擊，導致模型組大鼠毛豎立、對峙、尖叫，甚至打斗、撕咬等[4]。按照Davidson等[5]對大鼠憤怒表情和行為的描述，模型組的表現符合憤怒應激狀態特征。該方法把對模型組大鼠的軀體應激降到了最低，且具有憤怒情緒引出率高、程度適中、可持續時間長等優點，是目前研究長期憤怒情緒積累較為理想的模型。

1.2 改良慢性溫和不可預知應激建立大鼠長期復合負性情緒應激模型

慢性溫和不可預知應激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）可模擬人類因經歷多種身心刺激產生的復合性負性情緒，在動物情緒相關實驗中被廣泛應用。但傳統CUMS中的直接電擊、冰水游泳等易對動物產生軀體應激，所產生的心理應激不夠純粹。課題組通過反復實驗，用間接電擊代替直接電擊，溫水游泳代替冰水游泳，合理控制軀體應激成分，最終確立了適宜長期負性情緒應激動物建模的CUMS方法，為長期復合負性情緒應激的動物實驗研究打下了良好基礎[6]。

1.3 創制正常人群憤怒情緒誘發影片

以正常人為被試開展情緒研究，關鍵需激活所要研究的靶情緒。因影片通過視、聽雙通道輸入刺激，可以使被試身臨其境，因而是一種理想的情緒誘導方法。但目前國內外憤怒情緒影片均存在誘發情緒較為彌散，憤怒情緒優勢不顯著，分化和單一性欠佳等缺陷。因此課題組在參考國內外研究前沿的基礎上，走訪導演、制片人、攝像等多名國內電影界人士，并閱讀電影評介，在河南電影制片廠對多部影片進行非線性編輯，歷時8個多月，制作了4段憤怒情緒誘發影片和4段中性情緒誘發影片（對照）。以誘發強度、靶情緒擊中率和靶情緒與非靶情緒的顯著性差異為評定指標，經兩次試驗評定及優化處理，最終憤怒影片《罪惡與審判》和中性影片《漁舟唱晚》誘發的靶情緒強度較高，占主導地位，情緒優勢突出，有較好的分化性和單一性，因此選定以上兩段影片分別作為憤怒、中性情緒誘發影片（每段影片長度約13 min）[7]。上述情緒誘發影片解決了目標情緒激活質量這一決定憤怒情緒研究成敗的關鍵問題，有利于憤怒情緒相關研究的開展。

2 多角度揭示負性情緒長期積累對腦老化進程的影響及其機制

2.1 動物實驗研究

課題組研究發現無論單一負性情緒（憤怒）還是復合負性情緒長期積累均可使D-半乳糖（D-gal）腦老化大鼠發生如下變化：①Morris水迷宮尋臺時間延長，學習記憶能力下降[8-9]；②大腦皮層和海馬CA1區組織萎縮，神經細胞數量減少，海馬神經元線粒體嵴變短、突觸小泡數量減少、突觸活性帶縮短、突觸后膜突觸致密物質厚度變薄，海馬糖皮質激素受體減少[10-12]；③血漿促腎上腺皮質激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）、皮質酮水平升高，5-羥色胺水平降低[8-11]。說明無論單一負性情緒（憤怒）還是復合負性情緒長期積累均可加重大鼠大腦皮層和海馬的退行性病變、神經元突觸可塑性障礙，加速大鼠腦老化進程。其機制可能與下丘腦-垂體-腎上腺軸持續激活、單胺類神經遞質紊亂和海馬應激性損傷有關。此外，復合負性情緒長期積累還可導致大鼠海馬神經元內谷氨酸含量、鈣離子（Ca2+）濃度、N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體含量增高，鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）和磷酸化環腺苷酸反應元件結合蛋白含量下降[13]；導致D-gal腦老化大鼠海馬神經元NMDA受體-2B亞型基因啟動子區CpG甲基化程度及DNA甲基化轉移酶1活性增高[9]；提示復合負性情緒長期積累加速大鼠腦老化進程的機制還可能與海馬Ca2+/CaM-鈣調蛋白激酶（CaMK）Ⅱ-環腺苷酸反應元件結合蛋白信號通路及NMDA受體-2B亞型基因甲基化有關。上述結果為課題組的假說提供了實驗證據。

2.2 病例對照研究

以阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者為病例組，以同性別、同年齡段、同等教育程度1∶1匹配正常被試為對照組開展研究。結果 顯示，AD患者特質怒量表得分更高，高特質怒者更多，高特質怒人群發生AD的概率更大[14]。提示憤怒情志與AD發病相關，長期憤怒情緒積累是AD發病的危險因素。

由于AD患者的認知功能衰退不可逆，而MCI是介于正常衰老和癡呆的中間狀態，是認知過速衰退早期干預的最合適群體，已成為近年腦老化研究領域的焦點。因此課題組以MCI患者為病例組，按照同性別、同年齡組、同文化教育程度1∶1匹配正常被試為對照組開展研究。結果 顯示，MCI患者正負性情緒量表（擴展版）中的負性情緒量表得分更高（t=-3.077，P=0.003），高負性情緒特質者更多（χ2=10.694，P=0.001），OR=5.364，95% CI為（1.774，16.225），高負性情緒特質人群發生MCI的概率更大，提示負性情緒與MCI發病相關，長期負性情緒積累是MCI發病的危險因素。上述結果為課題組的假說提供了流行病學證據，提示應重視調暢情志在AD和MCI防治中的作用。

2.3 正常人群研究

探討憤怒情志對工作記憶容量影響及高、低特質怒被試神經電生理差異的研究對被試年齡無特殊要求，只要是成年人即可。因此課題組以平均年齡21歲的在校正常大學生為對象，采用國際通用的狀態-特質憤怒表達量表2篩選高、低特質怒被試。發現觀看憤怒情緒誘發影片后高特質怒被試的數字回憶正確率低，提示高憤怒喚醒狀態者的數字工作記憶容量更易受損[15]。以Go/Nogo范式采集并比較高、低特質怒被試平靜狀態下的事件相關電位（Event-Related Potentials，ERPs），發現低特質怒被試順利誘發出了Nogo效應，而高特質怒被試Go條件下產生的P3波增大，因而其差異波較小，Nogo效應不明顯[16]。提示易怒者的認知加工激活程度較高，即使在處理正常刺激信息時也投入了較多的認知資源，致使其能夠動員的抑制控制能力不足。

以40-65歲已進入衰老及腦老化階段且基礎疾病較少的正常人群為對象，采用艾森克人格問卷（Eysenck Personality Questionnai，EPQ）中的N量表篩選情緒穩定、不穩定型被試。發現情緒不穩定被試有如下改變：①血漿去甲腎上腺素含量升高[17]；②ERPs進行中任務及前瞻性任務的N1波幅均更大[17]；③尿8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）含量及血漿過氧化脂質含量升高，端粒長度縮短、端粒酶活性降低[17]；④反應速度及反映認知功能年老化的流體智力水平均有所下降[17]。提示情緒不穩定型的中老年人易處于情緒應激狀態，占用更多的早期注意資源，對無關信息的干擾抑制能力降低，影響了對認知資源的合理分配，衰老及腦老化更加明顯。

以上正常人群研究突破了動物實驗和臨床研究的局限，獲取了若負性情緒長期積累加速腦老化進程可能的直接生理證據。

3 提出“肝藏象具有個體差異”，發現中醫肝藏象個體差異的部分遺傳背景和神經電生理證據

3.1 提出“肝藏象具有個體差異”

“肝主疏泄，調暢情志，在志為怒”是中醫學的重要命題。課題組發現個體憤怒情志的啟動、表達和控制存在較為穩定一致的傾向性，這種傾向可在一定程度上反映“肝藏”功能傾向的個體差異[18]。因此，課題組提出“肝藏象具有個體差異”的觀點，并進行了如下實驗研究，發現了其遺傳背景和神經電生理基礎。

3.2 發現中醫肝藏象個體差異具有遺傳背景

課題組以正常大學生為研究對象，對憤怒特質與神經遞質代謝酶基因多態性的關系展開研究。發現高特質怒者下列憤怒特質與色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）基因A218C多態性有關：發怒特質，女性怒的表達特質，男性郁怒特質及控制發怒特質；低特質怒者下列憤怒特質也與該位點多態性有關：郁怒特質，怒的控制特質，控制發怒特質，控制郁怒特質及女性控制發怒特質。此外低特質怒女性的控制發怒特質還與單胺氧化酶A（Monoamine oxidase A，MAOA）基因tag SNP rs2235186多態性有關[18]。以上結果表明中醫肝藏象個體差異確有遺傳背景。

3.3 發現中醫肝藏象個體差異具有神經電生理基礎

采用ERPs技術，以Go/Nogo范式采集并分析正常人群中不同憤怒特質者的腦電。①對憤怒啟動特質的研究顯示：高特質怒者完成Go任務時的反應時短，錯報率高，P3波幅大；低特質怒者誘發出了Nogo效應，而高特質怒者Nogo效應不明顯，提示肝失疏泄易怒傾向者認知加工激活程度較高，而抑制控制能力較低[16]。②對憤怒表達特質的研究顯示：肝疏泄不及郁怒傾向者Nogo-N2波幅較肝疏泄太過發怒傾向者小，提示肝氣郁傾向者較肝氣逆傾向者沖突監控能力弱[19]。說明中醫肝藏象個體差異確有相應的神經電生理基礎。

上述研究拓展了肝藏象的內涵，深化了對于肝藏象生理功能個體差異的認識，有利于肝失疏泄腦老化過速等相關疾病的早期預警和個體化預防。

4 發現MCI可能的早期客觀診斷指標

以長期肝氣郁結MCI患者為對象，把高時間分辨率的ERPs和高空間分辨率的功能磁共振成像（Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI）等技術結合，探討患者的神經電生理及影像學特征。①ERPs實驗的Oddball范式中MCI患者P3a潛伏期延長[20]；Nback范式中MCI患者的正確率降低，N200、N400波幅增大，P300潛伏期縮短（P3b的誘發失敗）、波幅減小[21]。提示肝氣郁結MCI患者注意朝向困難，工作記憶信息編碼和儲存能力及語義加工能力下降。②fMRI結果顯示，MCI患者左側枕中回和島蓋部額下回低頻振幅（Amplitude of Low Frequency Fluctuation，ALFF）值降低，提示患者上述腦區興奮性下降[22]。MCI患者左海馬與右舌回、右距狀裂周圍皮層之間的功能連接（Functional connectivity，FC）下降，提示大腦“執行控制網絡”抑制干擾信息的功能受損[23]。MCI患者左側額下回、左側額中回和左側中央前回的局部一致性（Regional Homogeneity，ReHo）減弱，提示上述腦區神經元自發活動的同步性降低[24]。由此可見，ERPs和fMRI的ALFF、FC和ReHo分析可較為靈敏地區分長期肝氣郁結的MCI患者和正常被試，為腦認知疾病的早期篩查和診斷提供了可能的客觀檢測指標。

5 探明疏肝法可改善MCI患者的認知功能及其機制

依據所提出并初步驗證的“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”假說，自2012年開始課題組應用蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）、肝氣郁結證癥狀程度計分表、艾森克人格問卷（Eysenck Personality Questionnai，EPQ）、正負性情緒量表（擴展板）等在河南省內多個地級市開展流行病學調查，并利用fMRI、磁共振波譜（Magnetic Resonance Spectrum，MRS）及ERPs等技術發現的腦老化早期客觀診斷指標為1120人進行了檢測，對篩查出的115名肝氣郁結MCI患者行疏肝法干預，取“知肝傳脾，當先實脾”既病防變之意，服用疏肝解郁名方逍遙丸3個月。結果 顯示：患者肝氣郁結評分下降、認知功能提高，神經內分泌、氧化應激、fMRI、MRS及ERPs相關指標得到改善，臨床療效顯著。具體如下：①神經心理學評估結果顯示，患者用藥后的抑郁及肝氣郁結程度均降低，MoCA量表及中國修訂韋氏成人智力量表四合一簡式總分均升高[25-26]。②衰老生物學和神經內分泌指標顯示，患者用藥后外周血單個核細胞端粒酶活性升高，尿8-OHdG含量及血漿ACTH水平降低[25-27]。③ERPs Oddball實驗結果顯示，患者用藥后P3a潛伏期縮短[28]；N-back實驗發現，患者用藥后P300潛伏期整體延長（誘發了P3b），N200潛伏期縮短，N400波幅和潛伏期均減小[21]。④fMRI和MRS檢測發現，患者用藥后右側枕中回ALFF值降低，左側顳上回和左側顳中回ALFF值增高，右后扣帶回膽堿/肌酸（Ch/Cr）比值降低[22,29]。表明疏肝法能夠改善長期肝氣郁結MCI患者的抑郁情緒、肝氣郁結癥狀和認知功能，其療效機制可能與恢復HPA軸功能狀態和減輕組織氧化損傷，增強注意力朝向、工作記憶刺激識別、信息編碼儲存及語義加工能力，減輕右后扣帶回神經元損傷、提升“執行控制網絡”抑制干擾信息的功能及左側顳上回和顳中回的興奮性有關。上述結果反證了課題組假說的正確性，在傳統的補腎健脾、活血化瘀之外為認知老化過速相關疾病的防治提供了以疏肝為主的新方案。

6 小結

綜上所述，課題組圍繞“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”假說開展研究，歷經10余載，“病因”從單一情緒擴展到復合情緒；“對象”從嚴重的阿爾茨海默癥到輕度認知功能障礙再到正常人群，研究重心前移，體現了防治結合、未病先防的研究理念；“方法”從動物實驗、正常人群、病例對照到臨床干預研究，多層面全方位證實了上述假說，并從神經內分泌、鈣/鈣調蛋白通路、表觀遺傳學等方面論證其分子機制。其后，進一步挖掘中醫肝藏象的科學內涵，深化了對肝藏象生理功能個體差異的認識，推動了肝失疏泄腦老化過速等相關疾病的早期預警和個體化預防。此外，借助ERPs和fMRI等現代科學技術，找到了認知功能損傷的早期敏感成分，為疾病篩查和臨床診斷提供了生物學證據，彌補了既往依靠量表診斷的主觀缺陷。同時，疏肝法防治認知老化過速相關疾病取得確切療效，拓展了傳統經典方藥的適用范圍。而正常人群的生理研究則改變了動物實驗和臨床研究結果難以直接推論到正常人體的局面，是中醫藏象研究方法的突破。該系列研究為神經退行性疾病的預警提供了病因學、分子遺傳學、神經生理學及影像學依據，為情志相關腦老化過速疾病提供了從肝論治的新方案。

該系列研究也存在一定的局限性。如課題組發現我國正常大學生某些憤怒特質與神經遞質代謝酶基因多態性有關，但不同的種族或地域可影響基因多態性的分布，在研究開展時課題組尚未能完全排除上述因素的影響，這可作為今后努力的方向，以使結果更具普適性。