益氣解毒復方對重癥肌無力患者中醫證候影響及Th17/Treg細胞免疫調節作用*

劉亞林，吳遠華，郭青，蔡友德，王珊珊，李襯，何前松**

（1.貴州中醫藥大學第一臨床醫學院 貴陽 550025；2.織金縣中醫醫院 畢節 552100；3.貴州醫科大學附屬金陽醫院 貴陽 550018）

重癥肌無力（Myasthenia gravis，MG）是由自身抗體介導的獲得性神經-肌肉接頭傳遞障礙的自身免疫性疾病，以自發性肌無力和肌疲勞為主要臨床表現[1]。MG的治療是世界性的難題，主要以控制癥狀和預防急性加重為臨床治療目標[2]。近年來，多項研究報道，維持Treg/Th17細胞免疫平衡在MG的治療中顯得尤為重要[3-4]，根據中醫辨證論治，中藥多成分、多中心、多靶點的作用特點，使得中醫藥對Th17/Treg細胞的免疫調節是免疫介導炎癥性疾病治療的新途徑[5]，且諸多國內醫家運用中醫藥治療MG已取得了一定的效果[6-7]。

益氣解毒復方（原補脾強力復方）由貴州中醫藥大學第二附屬醫院況時祥教授在總結前人理論基礎上，結合長期臨床觀察而創立。該方以“虛、毒、結、損”為MG病機特點，以“補脾益腎、扶陽益損、解毒散結”為治療原則[8]，臨床療效顯著。根據文獻研究，益氣解毒復方可調節MG患者外周血中T淋巴細胞亞群的比例，進而調節機體的免疫力，達到治療MG的效果，顯著性提高臨床總有效率[9]。而常規西醫治療聯合益氣解毒復方，治療MG療效顯著，可協同增效，其機制可能與上調血清Tfr/Tfh細胞比值及減少白細胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）及抗乙酰膽堿受體抗體（AchR-Ab）水平有關[10]。

有研究報道，在MG患者CD4+T細胞中，Th17細胞比例及其相關細胞因子表達量顯著增加，而Treg細胞比例及其相關細胞因子表達量顯著降低[11]。為進一步明確益氣解毒復方對MG患者T淋巴細胞Th17/Treg細胞及細胞因子表達的影響，觀察了該方對MG患者外周血中Th17、Treg細胞百分比及外周血中叉頭框蛋白p3（Foxp3）、視黃酸受體相關孤兒受體-γt（RORγt）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）等表達水平的影響，以期為臨床運用益氣解毒復方治療MG提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機將63例重癥肌無力患者分為對照組（n=31）和治療組（n=32）。對照組中有男性患者11例，女性患者20例，年齡20-70歲，平均為42.45歲，病程的中位數和四分位數間距為3.0（1.0，5.0）年。治療組患者中有男性8例，女性24例，年齡20-70歲，平均為40.38歲，病程的中位數和四分位數間距為2.0（1.0，6.8）年，組間無統計學差異（P＞0.05)。

1.2 納入標準

①符合MG診斷標準[12-13]。②符合美國重癥肌無力基金會（Myasthenia gravis foundation of America，MGFA）臨床分型中Ⅰ、IIa及IIb型者。③性別不限，18-70歲之間。④中醫證候可見主癥：眼瞼下垂、肢體乏力、復視；次癥：頭暈目眩，納差、便溏；面色少華；少氣懶言；肢體困重；目睛轉動不靈。舌診：舌質淡、胖大或舌邊有齒痕；苔薄白或白膩。脈診：脈弱細或緩弱或脈濡或脈滑。患者具有主癥中任何一項+舌脈診中任何一項，或主癥+兼次癥+舌脈診中任何一項。⑤已簽署知情同意書。

1.3 排除標準

①不符合納入標準者；②合并嚴重肝腎功能不全、心腦血管疾病等患者；③對治療過程中出現藥物過敏者。

1.4 脫落標準

①患者未根據實驗設定的治療方案或自行改變原計劃治療方法；②在治療期間出現肌無力危象者，如眼肌型患者分型轉化且惡化，或病情加重，出現吞咽、咳痰及呼吸費勁，或明顯的氣促、氣喘表現，可伴隨發紺、意識障礙、呼吸衰竭。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組治療方案

根據課題組前期研究[10]，給藥溴吡斯的明片（上海中西三維藥業有限公司，國藥準字H31020867）60 mg/次，3-4次/日，癥狀好轉后可逐漸減量至停藥。Ⅰ型：單純眼肌型，運用醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021007）0.5-1.0 mg·kg-1口服，每日1次，晨起頓服，療程6-8周，病情穩定后逐漸減量。Ⅱa型：輕度全身型，口服膽堿酯酶抑制劑加中等劑量糖皮質激素，起始用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，國藥準字號：H20130301，注射用）120-80 mg·d-1，靜脈注射3-5天，減量至80-60 mg·d-1，然后改為口服，口服方法同Ⅰ型。Ⅱb型：中度全身型及以上或頑固性眼肌型，口服膽堿酯酶抑制劑加用短程大劑量激素，甲潑尼龍琥珀酸鈉（500 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，國藥準字號：H20130303）500-1000 mg·d-1靜脈注射3-5天，依次減量為500 mg·d-1（使用1000 mg沖擊者）、250 mg·d-1、120 mg·d-1，分別靜脈注射3-5天后，改為口服，口服方法同上。服用激素期間，常規口服補鈣、補鉀藥物預防電解質紊亂，泮托拉唑等預防激素副作用。

1.5.2 治療組（益氣解毒復方）治療方案

在對照組的基礎上加服益氣解毒復方丸劑，每次1丸，早晚服用，療程為12周。益氣解毒復方丸劑由黃芪、土茯苓、人參、仙靈脾、生地黃、漏蘆、白芥子等組成，經貴州中醫藥大學第二附屬醫院中藥房制成丸劑，制作過程遵循無菌原則，嚴格無污染，制作完成后密封存放于4℃冰箱，標記后分發給受試者。

1.6 標本的采集與存放

分別抽取入組MG患者治療前、后外周靜脈血兩管，其中肝素抗凝管用于流式細胞分析和反轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的檢測，并于抽取后24 h內進行檢測；生化促凝管用于細胞因子及抗體檢測，抽取后離心取上清液，于-20℃冰箱保存備用，采用酶聯免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）進行檢測。

1.7 觀察指標

1.7.1 中醫證候積分

用中醫證候量表評估患者中醫證候積分，包括：眼瞼下垂、眼球運動障礙、視歧、脘腹脹滿、肢體困重、食少納呆、便溏、便秘、腰膝酸軟及口干口苦等10個項目，每項0-3分，滿分30分，分值與病情成正相關。評分細則如下：0分=無；1分=偶有發生，癥狀較輕，休息可緩解；2分=經常發生，癥狀較重，休息后可緩解；3分=持續存在，影響正常工作生活。

1.7.2 臨床療效評定

參照胡國恒等[14]的制定的療效評定方法評分，治療前判定值（X）＝（療前分值-療后分值）/療前分值×100%。痊愈：X＞3/4；顯效:3/4＞X＞3/5；有效:3/5＞X＞1/3；無效:X＜1/3。總有效率=（總例數-無效例數）/總例數×100%。

1.7.3 流式細胞術檢測外周血中Th17、Treg細胞比例

根據流式細胞儀應用淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的前向散射光（Forward scatter，FS）和側向散射光（Side scatter，SS）不同特征，分離分析淋巴細胞的原理[15-16]，檢測外周血中Th17、Treg細胞比例。分別抽取入組MG患者治療前、后外周靜脈血進行檢測分析。主要胞內抗體IL17A-PE、Foxp3-PE以及膜抗體CD3-APC、CD8-PerCPCY5.5、CD4-FITC、CD25-APC均購于美國BD公司（Becton，Dickinson and Company，USA）。按說明書配制紅細胞裂解液，Foxp3破膜劑與Foxp3破膜劑洗滌液；參考文獻操作步驟[16]，制備上機待測液；根據LSR Fortessa流式細胞儀操作規程，上樣檢測分析。

1.7.4 RT-PCR技術檢測血液中Foxp3、RORγt基因表達量

根據RT-PCR技術原理[17-18]，采用實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：CFX96）進行RT-PCR分析。根據TaKaRa試劑盒說明書提取總RNA，并將其逆轉錄為cDNA，產物進行PCR擴增，擴增條件及引物設計參考文獻[19]。結束后計算各樣本測定基因的循環閾值（Cycle threshold，Ct）與內對照β-action基因差值Δ Ct，根據ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt，結果以2-ΔΔCt表示mRNA相對表達量。

1.7.5 ELISA法檢測外周血中IL-6、IL-17表達水平

根據酶聯免疫吸附檢測法（ELISA法）的應用特點[20-21]，采用酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：Multiskan? FC），參照人IL-6試劑盒（Abcam，批號：ab178013）、IL-17試劑盒（Abcam，批號：ab119535）說明，分別檢測治療前和治療后外周血中IL-6、IL-17的表達水平。

1.8 統計方法

所有數據均使用SPSS 26.0 （Statistical Product Service Solutions）軟件進行統計分析，計量資料用均值±標準差（±s）表示，符合正態分布，用獨立樣本T檢驗，治療前后用配對T檢驗；不符合正態分布，用非參數檢驗。計數資料用例（率）表示，用χ2檢驗。方差齊性，組間比較用單因素方差分析。結果 以P＜0.05，差異具有顯著性；P＜0.01，差異具有極顯著性。

2 結果

2.1 中醫證候積分比較

治療前，對照組和治療組患者的中醫證候積分差異不明顯（P＞0.05）；與治療前比較，治療后兩組患者的中醫證候積分明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；治療后，與對照組相比，治療組患者的中醫證候積分明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05），表明益氣解毒復方能有效改善MG癥狀。結果 見表1。

表1 兩組患者治療前后中醫癥積分比較M（P25, P75）

2.2 中醫療效比較

治療組臨床總有效率高于對照組，差異顯著（P＜0.05），表明益氣解毒復方可明顯提高MG臨床療效。結果 見表2。

表2 治療組和對照組的中醫臨床療效比較[例(%)]

2.3 Th17/Treg細胞的百分比變化比較

治療前，兩組患者外周血中Th17/Treg細胞的百分比相比無顯著差異（P＞0.05）；治療后，兩組患者外周血中Th17/Treg細胞的百分比相比差異顯著，治療組（益氣解毒復方）可顯著升高Treg細胞的百分比、降低Th17細胞的百分比（P＜0.05)，表明益氣解毒復方可能通過調節Th17/Treg細胞的百分比而改善MG癥狀。結果 見表3。

表3 兩組患者治療前后外周血中Th17/Treg百分比比較（±s）

表3 兩組患者治療前后外周血中Th17/Treg百分比比較（±s）

注：與治療后對照組相比，##P＜0.01。

組別對照組治療組（益氣解毒復方）n 31 32時間治療前治療后治療前治療后Th17 5.04±1.52 3.03±0.67 4.57±1.56 1.97±0.49##Treg 4.60±1.33 4.60±1.19 4.45±0.86 7.55±1.26##

2.4 Foxp3和RORγt基因表達量比較

治療前，兩組患者治療前后外周血中Foxp3和RORγt基因表達相比無顯著差異（P＞0.05）；治療后，兩組患者治療前后外周血中Foxp3和RORγt基因表達相比差異顯著，與對照組比較，治療組Foxp3基因表達量顯著升高，RORγt基因表達量顯著降低（P＜0.05），表明益氣解毒復方可能通過升高Foxp3基因，下調RORγt基因水平改善MG癥狀。結果 見表4。

表4 兩組患者治療前后外周血中RORγt和Foxp3基因表達量比較（±s）

表4 兩組患者治療前后外周血中RORγt和Foxp3基因表達量比較（±s）

注：與治療后對照組相比，##P＜0.01。

組別對照組治療組（益氣解毒復方）n 31 32時間治療前治療后治療前治療后RORγt mRNA 2.84±0.54 2.53±0.45 3.01±0.74 1.99±0.43##Foxp3 mRNA 2.40±0.70 3.80±1.03 2.30±0.56 4.50±0.76##

2.5 IL-6、IL-17細胞因子表達水平比較

治療前，兩組患者外周血中IL-6、IL-17細胞因子表達水平相比無顯著差異（P＞0.05）；治療后，與對照組比較，治療組患者外周血中IL-6、IL-17細胞因子表達水平顯著降低（P＜0.05），表明益氣解毒復方可能通過下調IL-6、IL-17細胞因子表達水平改善MG癥狀。結果 見表5。

表5 兩組患者治療前后外周血中IL-6、IL-17細胞因子表達水平比較（±s）

表5 兩組患者治療前后外周血中IL-6、IL-17細胞因子表達水平比較（±s）

注：與治療后對照組相比，##P＜0.01。

組別對照組治療組（益氣解毒復方）n 31 32時間治療前治療后治療前治療后IL-6 21.40±1.58 7.20±1.21 22.14±1.43 4.70±0.84##IL-17 18.05±4.01 9.25±2.11 18.35±3.96 7.83±1.97##

3 討論

重癥肌無力（MG）屬于中醫學之“痿病”、“瞼廢”等范疇。歷代醫家多從五臟虛損的角度論治MG，取得了一定療效[7,22-24]。課題組前期研究認為MG的發病與“毒邪”有關，運用益氣解毒復方治療MG臨床療效較好，且可減輕激素的依賴性[8,25]。同時，研究證實益氣解毒復方可明顯促進MG患者胸腺髓質上皮細胞（mTEC）和調節性T細胞（Treg）的增殖[26]。本研究結果顯示，運用益氣解毒復方治療12周后，與對照組比較，可改善MG患者的臨床癥狀，顯著降低MG患者的中醫證候積分（P＜0.05），提高臨床總有效率（P＜0.05），但其作用機制尚不清楚。

MG的發病機制十分復雜，涉及到免疫調控細胞、效應T細胞、B細胞、補體及自身免疫性抗體等多個環節。已有研究顯示，Th17/Treg免疫平衡在MG的病理進程中起著至關重要的作用[27]，二者具有共同的來源CD4+T細胞，在維持著機體免疫功能方面具有拮抗作用[28]。就MG的發生發展而言，Th17則可促進MG的發展，而Treg則可抑制MG的發展，兩者相互拮抗[29]。研究表明，Th17細胞分泌的IL-17可促使B淋巴細胞產生致病性的AChR-Ab參與MG的病理過程[30]；而IL-17不僅能抑制Treg的分化，還能反過來促進Th17的分化，形成惡性循環推動病情進展[31]。研究發現，RORγt與Foxp3分別是驅動Th17和Treg細胞分化所必需的轉錄因子[32]；有研究顯示，通過上調Foxp3的轉錄和表達可增強自身免疫抑制，調控淋巴細胞因子使其恢復免疫平衡穩態，達到治療MG的效果[33]；RORγt可誘導Th17細胞的分化，促使炎癥因子的釋放介導自身免疫性炎癥的發生[34]。RORγt與Foxp3的數量或性質改變可導致Th17/Treg失衡導致MG的發生。此外，有研究報道，細胞因子IL-6在協調Th17細胞的分化方面扮演者重要的角色[32]，可通過激活RORγt的表達，促使CD4+T淋巴細胞分化為Th17細胞[4]。而本研究結果顯示，聯合益氣解毒復方治療后，與對照組相比，治療組可顯著降低外周血中細胞因子IL-6、IL-17和RORγt基因的表達水平，以及降低Th17細胞百分比（P＜0.05），顯著升高外周血中Foxp3基因的表達及Treg細胞百分比（P＜0.05）。

綜上所述，在常規西藥的基礎上，聯合益氣解毒復方能明顯改善MG患者的臨床癥狀，降低MG患者的中醫證候積分，其作用機制可能通過調節外周血中細胞因子IL-6與轉錄因子RORγt、Foxp3的表達，進而影響Th17、Treg的分化，減少炎性因子IL-17的釋放，減輕免疫炎癥效應，以達到調節外周血中Th17/Treg細胞間的平衡作用。因此，本研究治療方案為中西醫結合治療MG，加服益氣解毒復方能起到協同增效作用，具有較好的治療前景。由于復方中藥具有多成分、多中心、多靶點的作用特點，為了進一步論證該復方對MG患者的改善作用，明確藥效物質基礎，闡明作用機制，后期研究將增加復方純中藥治療組，以期為該復方制劑的研究開發和應用推廣奠定良好的實驗基礎。