草莓果生炭疽菌LysM效應子CfLysM2的致病功能分析

余永婷 李水根 方獻平 張昊 安海山 張學英 張麗勍

摘要

果生炭疽菌Colletotrichum?fructicola侵染引起的草莓炭疽病是草莓生產中的重要病害。前期研究發現一個在果生炭疽菌侵染階段高表達的含LysM結構域的候選效應子CfLysM2。為進一步研究CfLysM2的致病功能，運用同源重組方法構建CfLysM2缺失突變株ΔCfLysM2和回補菌株CfLysM2c。致病力測定結果表明，接種后15?d，ΔCfLysM2接種的草莓葉片病情指數顯著下降。熒光定量PCR分析表明CfLysM2基因在果生炭疽菌接種草莓葉片后24?h相對表達量最高。利用轉錄組技術對野生型菌株（wildtype?strain，?WT）和ΔCfLysM2接種后24?h的草莓葉片樣品進行比較分析，獲得差異表達基因109個。CfLysM2的缺失導致宿主代謝途徑尤其是次生代謝物生物合成通路的激活，說明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓過程中通過靶向黃酮醇合成酶等代謝相關基因，抑制植物次生代謝產物合成及其介導的抗真菌免疫，保證其順利侵染。該研究為揭示CfLysM2機理及對果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理論基礎。

關鍵詞

果生炭疽菌;?LysM?結構域;?致病性;?轉錄組

中圖分類號：

S?436.68

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022074

Functional?analysis?of?the?LysM?effector?CfLysM2?in?the?pathogenicity?of?Colletotrichum?fructicola?on?strawberry

YU?Yongting1，?LI?Shuigen1，?FANG?Xianping1，?ZHANG?Hao2，?AN?Haishan1，

ZHANG?Xueying1*，?ZHANG?Liqing1*

（1.?Forest?&?Fruit?Tree?Research?Institute，?Shanghai?Academy?of?Agriculture?Sciences，?Shanghai?Key?Laboratory

of?Protected?Horticultural?Technology，?Shanghai?201403，?China;?2.?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agriculture?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

Strawberry?anthracnose?caused?by?Colletotrichum?fructicola?is?an?important?disease?in?strawberry?production.?A?candidate?effector?CfLysM2?containing?LysM?domain?highly?expressed?during?the?infection?of?Colletotrichum?fructicola?was?identified?in?the?previous?study.?To?further?study?the?pathogenic?function?of?CfLysM2，?a?CfLysM2?deletion?mutant?ΔCfLysM2?and?a?complementary?strain?CfLysM2c?were?constructed?by?homologous?recombination.?The?results?of?pathogenicity?assay?showed?that?the?disease?index?decreased?significantly?15?days?post?inoculation?with?the?mutant?strain.?Realtime?quantitative?PCR?analysis?showed?that?the?relative?expression?of?CfLysM2?was?the?highest?24?h?post?infection?by?C.fructicola?in?strawberry?leaves.?The?transcriptome?technology?was?used?to?compare?and?analyze?strawberry?leaf?samples?24?h?after?inoculation?of?wildtype?strain?and?mutant?strain?ΔCfLysM2，?respectively.?The?results?showed?that?there?were?109?differentially?expressed?genes.?Knockout?of?CfLysM2?led?to?the?activation?of?host?metabolic?pathways，?especially?the?biosynthetic?pathway?of?secondary?metabolites，?indicating?that?CfLysM2?might?inhibit?the?synthesis?of?plant?secondary?metabolites

and?metabolitemediated?antifungal?immunity?to?ensure?its?successful?infection?by?targeting?metabolismrelated?genes?such?as?flavonol?synthase?during?infection.??This?study?lays?a?theoretical?foundation?for?revealing?the?functional?mechanism?of?CfLysM2?and?for?the?study?of?the?interaction?between?C.fructicola?and?strawberry.

Key?words

Colletotrichum?fructicola;?LysM?domain;?pathogenicity;?transcriptome

草莓Fragaria×ananassa?Duch.屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是我國傳統的優秀果品之一［1］。然而，草莓病害一直制約草莓產業的發展，草莓炭疽病在我國乃至世界各地的草莓主產區一直是制約草莓產業持續穩定發展的主要瓶頸。草莓炭疽病指由炭疽菌屬Colletotrichum?spp.真菌引起的草莓病害。在我國草莓生產中，炭疽病危害嚴重的年份直接導致草莓減產50%～80%，甚至絕產［2］。團隊前期研究結果表明果生炭疽菌?Colletotrichum?fructicola為華東地區草莓炭疽病菌的優勢種［3］。

細胞溶解酶基序（lysin?motif，?LysM）最初在芽胞桿菌噬菌體的溶菌酶中發現［4］。LysM結構域存在于原核生物和真核生物的蛋白質中［5］，由大約?40個氨基酸殘基組成［6］。在真核生物的?LysM?結構域中存在多個半胱氨酸殘基和二硫鍵，以維持蛋白質的結構穩定性［7］。迄今為止，已在真菌中鑒定出783種含LysM的蛋白［8］。

效應子是病原菌分泌的，通過干擾寄主植物細胞的活動來促進病原菌成功侵染和定殖的一類外泌型蛋白分子［9］。含有LysM結構域的效應子被稱為LysM效應子。幾丁質?（chitin）?是真菌細胞壁的重要組分之一，病原真菌在侵染寄主植物過程中釋放的幾丁質寡糖是重要的病原相關分子模式（pathogenassociated?molecular?patterns），能夠被寄主植物細胞膜表面的受體識別并激發寄主植物的先天免疫反應。病原真菌則分泌LysM效應子，通過競爭性結合游離幾丁質寡糖，阻斷其與寄主植物受體結合等手段，抑制幾丁質誘導的寄主植物免疫反應［1011］。該機制在番茄葉霉Cladosporium?fulvum中已經得到了充分的研究：番茄葉霉在侵染過程中分泌具有無脊椎動物幾丁質結合域?（CBM14）?的效應子?Avr4，結合番茄葉霉自身細胞壁幾丁質，從而保護菌絲免受番茄幾丁質酶的水解［12］。此外，番茄葉霉分泌的效應子Ecp6含有3個?LysM結構域，能夠結合幾丁質抑制其誘導的植物免疫。Ecp6?的晶體結構顯示其3個?LysM?結構域中的2個通過底物誘導的內鏈二聚化（intrachain?dimerization）建立了具有超高幾丁質結合親和力的凹槽，使?Ecp6?能夠與植物受體競爭結合幾丁質［13］。此外，LysM?效應子也被證明是病原真菌致病過程中的關鍵因素。不同真菌中LysM效應子的功能也不盡相同。小麥殼針孢葉枯菌?Mycosphaerella?graminicola?LysM效應子在病原菌的定殖過程中發揮作用［14］。希金斯炭疽菌Colletotrichum?higginsianum?LysM效應子ChELP1和ChELP2能夠控制附著胞的形成［15］。大麗輪枝菌Verticillium?dahliae?VdLs17菌株中的LysM?效應子基因VDAG_05180的缺失能夠導致菌株對番茄的致病力顯著下降［16］。

目前對果生炭疽菌致病相關基因已有研究，但其致病機理仍不清楚，尚未見果生炭疽菌LysM效應子的相關報道。研究組在前期工作的基礎上篩選獲得一個在果生炭疽菌侵染階段高表達的候選效應子CfLysM2［17］。本研究擬以CfLysM2基因為研究對象，通過構建CfLysM2缺失突變菌株（ΔCfLysM2），比較分析了野生型菌株（wildtype?strain，?WT）和ΔCfLysM2侵染的草莓葉片的轉錄組，觀察二者侵染后草莓葉片在代謝途徑和防御反應上的差異，旨在揭示果生炭疽菌侵染宿主過程中，CfLysM2通過何種途徑影響果生炭疽菌草莓互作，進一步影響果生炭疽菌致病性的機制。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

果生炭疽菌Colletotrichum?fructicola?野生型菌株SH01由上海市農業科學院林木果樹研究所保存。構建敲除載體和回補載體的pKHKO和pKN質粒由中國農業科學院植物保護研究所張昊副研究員惠贈。植物材料為草莓栽培品種‘紅顏。

PDA培養基：馬鈴薯?200?g，葡萄糖?20?g，瓊脂粉?20?g，定容到?1?L。CMC?培養基：羧甲基纖維素鈉15?g，磷酸二氫鉀?1?g，七水合硫酸鎂?0.5?g，硝酸銨?1?g，酵母提取物?1?g，加蒸餾水到?1?L。TB3?培養基：酵母提取物?3?g，酪氨酸水解蛋白?3?g，蔗糖?200?g，加蒸餾水到?1?L。以上培養基均經高壓滅菌，室溫保存。

1.2?試驗方法

1.2.1?CfLysM2基因序列分析

利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）在線生物信息學工具對CfLysM2效應子的結構域進行分析。通過UNIPROT（https：∥www.uniprot.org/）在線網站中的BLAST工具獲得其他病原真菌的LysM效應子的氨基酸序列。利用MEGA?7.0.26軟件中的鄰接法（neighborjoining?method，?NJ）構建系統發育樹。

1.2.2?CfLysM2基因的敲除與回補

利用E.Z.N.A.Fungal?DNA?Kit（Omega，美國）提取果生炭疽菌基因組DNA。以果生炭疽菌菌株的?DNA?為模板采用上游序列擴增引物（L2UF/L2UR），下游序列擴增引物（L2DF/L2DR），分別擴增出900?bp?的上游片段和?900?bp?的下游片段。引物序列見表1。在?USER?酶的作用下，將上游片段連接到敲除載體?pKHKO?的?BamH?Ⅰ/EcoR?Ⅰ位點上，下游片段連接到?pKHKO?質粒的?Xho?Ⅰ/Kpn?Ⅰ位點上。從而得到CfLysM2基因的敲除載體。將敲除載體用內切酶線性化，轉化至果生炭疽菌野生型菌株的原生質體中。原生質體的制備及轉化參照Desmond等［18］的方法。轉化子在潮霉素濃度為100?μg/mL?的PDA培養基上篩選。提取抗性轉化子基因組DNA，分別用引物?CfL2OF/CfL2OR檢測目的基因CfLysM2;引物?H850/H852檢測替代CfLysM2基因的潮霉素基因（Hph）?;引物CfL2TF/H850檢測重組左臂;引物?H852/CfL2TR檢測重組右臂。

分析CfLysM2?基因序列，設計引物CfL2F/CfL2R（表1），以野生型菌株的基因組DNA為模板進行PCR?擴增，獲得帶有?KpnⅠ和BamHⅠ位點的3?309?bp的片段，其中510?bp為CfLysM2基因的ORF序列。

PCR?產物純化后用KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切，酶切產物連接到同樣經KpnⅠ/BamHⅠ?雙酶切的pKN?中，獲得CfLysM2的回補載體。將回補載體用內切酶線性化后轉化到由CfLysM2?敲除突變體制備的原生質體中，利用G418抗性PDA培養基篩選，以抗性轉化子的基因組DNA為模板，用引物?CfL2OF/CfL2OR進行?PCR?驗證，能擴增出CfLysM2完整ORF的抗性轉化子為回補菌株CfLysM2c。

1.2.3?果生炭疽菌對草莓的致病性測定

參照柯智健等［19］的方法配制孢子懸浮液，將濃度為106個/mL的果生炭疽菌野生型菌株SH01、突變菌株ΔCfLysM2和回補菌株CfLysM2c的分生孢子懸浮液（含0.05%?tween20）用噴霧器均勻噴灑到草莓植株‘紅顏葉片上，直至霧滴滴下為止，各菌株分別接種10株，3次重復。以含有0.05%?tween20的無菌水為對照。覆膜黑暗28℃保濕24?h后于光周期L∥D=12h∥12h，相對濕度大于80%的條件下培養。接種后15?d調查葉片的發病情況。病情分級參考Wang等［20］（表2）。

病情指數（DI）=［∑（各級發病株數×病級值）／（最高發病級值×調查株數）］×100。

利用Excel?2016和SAS軟件對試驗數據進行匯總、處理和分析，通過單因素方差分析和LSD法比較草莓植株接種野生型菌株、ΔCfLysM2和CfLysM2c后病情指數的差異，結果用Excel?2016作圖。

1.2.4?病原菌侵染過程中CfLysM2基因表達量變化

以果生炭疽菌野生型菌株接種草莓‘紅顏葉片，采集接種后0、6、12、24、48?h和72?h葉片組織，液氮速凍后于-80℃保存備用。利用植物總RNA提取試劑盒（天根，中國）提取葉片總RNA，用RNA反轉錄試劑盒（全式金，中國）反轉錄成cDNA作為熒光定量PCR模板。依據基因CDS區序列，利用軟件Primer?5.0設計引物CfLysM2F/CfLysM2R（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以果生炭疽菌βactin基因為內參基因，按照SYBR?Premix?Ex?Taq?Kit?（TaKaRa，中國）說明書進行熒光定量PCR，用相對閾值法（2-ΔΔCt）計算侵染后不同時期組（6、12、24、48?h和72?h）與對照組（0?h）中CfLysM2基因表達差異，使用軟件GraphPad?Prism?5分析并作圖。

1.2.5?樣品準備

用果生炭疽菌野生型菌株及ΔCfLysM2的分生孢子懸浮液（106個/mL）分別接種草莓植株各10株，設置3次生物學重復。分別采集接種后24?h的草莓葉片，液氮速凍后保存于-80℃，用于轉錄組測序及差異表達基因的驗證。

1.2.6?RNA提取及文庫構建和測序

采用TRIzol法（Invitrogen?公司）分別提取1.2.5準備的草莓葉片樣本總RNA。利用Nanodrop?2000檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent?2100測定RIN值。文庫構建及測序工作均委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。使用美吉生物云平臺完成數據分析。

1.2.7?轉錄組數據質控及序列比對分析

對原始測序數據進行過濾得到高質量的測序數據（clean?data）。使用TopHat2?軟件（http;∥tophat.cbcb.umd.edu/）［21］將質控后的數據，即clean?data（reads）與草莓參考基因組（https：∥www.rosaceae.org/species/fragaria_x_ananassa/genome_v1.0.a1）進行比對分析，獲得用于后續分析的mapped?data（reads），同時對本次測序的比對結果進行質量評估。

1.2.8?差異基因篩選

利用軟件RSEM對轉錄本的表達量進行分析，定量指標為TPM（transcripts?per?million）值，以轉錄本的條數為計算單位。同組重復樣本的最終表達量為所有重復樣本數據的平均值。

使用基于負二項分布的DESeq2軟件進行分析，以|fold?change|≥2和Padj＜0.05為篩選條件得到差異表達基因（differentially?expressed?genes，?DEGs）。

1.2.9?功能注釋和富集分析

采用軟件?Goatools（https：∥github.com/tanghaibao/GOatools）［22］對差異基因進行GO富集分析，使用Fisher?精確檢驗得到P值，采用BH檢驗進行較正，當經過校正的?P?值（Padj）＜0.05時，認為此GO功能存在顯著富集情況。

將差異基因與?KEGG數據庫進行比對，默認當P值（P?value_uncorrected）＜0.05時，?認為此KEGG通路存在顯著富集情況。

1.2.10?差異表達基因的RTqPCR驗證

以1.2.5準備的草莓葉片為材料提取RNA，選取6個差異表達基因進行RTqPCR驗證，包括2個顯著差異表達的次生代謝相關基因，黃酮醇合成酶基因

（FLS）和過氧化物酶12基因（POX12）。用目的基因ID檢索薔薇科基因組數據庫GDR（https：∥www.rosaceae.org/），獲得目的基因序列。草莓actin基因作為內參基因。引物設計及RTqPCR方法同1.2.4。每份樣品3次生物學重復。使用軟件GraphPad?Prism?5分析并作圖。

2?結果與分析

2.1?CfLysM2生物信息學分析

利用SMART網站預測CfLysM2的結構域，發現其在N端（第51至95位，122至166位）具有2個典型的LysM結構域（圖1a）。對CfLysM2?的氨基酸序列

及其同源序列的系統進化樹分析發現，?LysM2在炭疽菌屬內相對保守，與同屬的膠孢炭疽菌C.gloeosporioides?Cg14?LysM2氨基酸序列的一致性為99%，與同屬的楊柳炭疽菌C.salicis、瓜類炭疽菌C.orbiculare、油茶炭疽病菌C.fioriniae、大豆炭疽

2.2?CfLysM2基因的敲除及回補

CfLysM2敲除、回補菌株構建策略如圖2a所示，野生型菌株僅能擴增出CfLysM2基因，以左右臂和Hph基因引物擴增無法獲得目的條帶（圖2b）;將敲除載體線性化后轉入以果生炭疽菌野生型菌株制備的原生質體中，共獲得40個轉化子，其中27號轉化子利用引物CfL2OF/CfL2OR不能擴增出CfLysM2基因目的條帶，而利用引物CfL2TF/H850、?H852/CfL2TR和H850/H852能夠分別擴增出目的條帶（圖2c）。由此確定第27號轉化子為敲除突變體，并將其命名為ΔCfLysM2。將回補載體pKNCfLysM2轉化到以敲除突變體ΔCfLysM2制得的原生質體中，經潮霉素培養篩選后，共得到20個轉化子。利用CfL2OF/CfL2OR引物對轉化子進行PCR鑒定，其中3號轉化子可以擴增出CfLysM2的ORF片段510?bp（圖2d），由此證明回補菌株構建成功，并將其命名為CfLysM2c。

2.3?CfLysM2基因的缺失影響果生炭疽菌的致病性

將野生型菌株、突變菌株ΔCfLysM2和回補菌株CfLysM2c采用噴霧法分別接種至草莓植株，接種后15?d，ΔCfLysM2的致病力明顯減弱，病情指數顯著低于野生型菌株和CfLysM2c（P

2.4?CfLysM2基因的表達分析

采用RTqPCR研究CfLysM2基因在接種后0、6、12、24、48?h和72?h的表達水平。?結果（圖4）顯示，CfLysM2基因在接種后24?h表達量達到最高，24?h后開始下調。因此選取野生型菌株和突變菌株ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h的樣本進行后續轉錄組測序。

2.5?轉錄組測序數據分析

通過RNAseq技術對果生炭疽菌野生型菌株

和ΔCfLysM2分別接種草莓葉片后24?h的6個樣品（WT1，WT2，WT3和LM21，LM22，?LM23）進行分析。各樣品用于組裝的測序數據Q30均高于94%。本次轉錄組測序結果可滿足后續組裝分析

的質量要求。將序列進行拼接和分析，與參考基因組比對，獲得用于后續表達量計算等的?mapped?data（reads）（表3），與6大數據庫（NR、

SwissProt、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）進行比對，獲得基因的注釋信息。

2.6?差異表達基因的GO分析結果

比較野生型菌株和ΔCfLysM2侵染草莓葉片轉錄本，共篩選出109個差異表達基因。以接種野生型菌株24?h后的草莓葉片為對照，其中上調表達基因的有79個（其中上調倍數最多的達233倍），下調表達的基因有30個（其中下調倍數最多的達167倍）。將差異表達基因進行GO功能分類，本研究中野生型菌株和ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h差異表達基因按GO功能分類歸為3類基因集：生物過程（biological?process）、分子功能（molecular?function）、細胞組分（cellular?component）（圖5）。在所有類別中，催化活性、代謝過程和結合3個類別是含有差異表達基因最多的3類。在各個類別中，生物過程方面主要富集在代謝過程、細胞過程、定位;細胞組分方面主要富集在細胞組分、膜組分;分子功能方面主要富集在催化活性、結合等功能類別。

2.7?差異表達基因的KEGG分析結果

對差異表達基因進行?KEGG功能分類，野生型菌株和ΔCfLysM2分別接種草莓葉片后24?h的差異表達基因中，共47個差異表達基因注釋到10個KEGG通路。KEGG總共有3類基因集，分別描述基因參與的代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic?information?processing）和生物系統（organismal?systems）（圖6）。與野生型菌株相比，ΔCfLysM2侵染草莓葉片后，上調基因占所有差異表達基因的87%（41/47），在所有上調基因中，代謝相關基因占所有差異表達基因的93%（38/41），說明果生炭疽菌侵染草莓葉片后，CfLysM2廣泛抑制了宿主的代謝途徑。在所有上調的代謝基因中，次生代謝途徑中的其他次生代謝物生物合成（biosynthesis?of?other?secondary?metabolites），萜類和聚酮類化合物代謝（metabolism?of?terpenoids?and?polyketides）是包含差異表達基因最多的兩大類別，占所有上調基因的54%（22/41）。除此之外，氨基酸代謝（amino?acids?metabolism）和其他氨基酸代謝（metabolism?of?other?amino?acids）中富集的差異表達基因僅次于次生代謝類別，占所有上調基因的24%（10/41）。另外，與野生型菌株相比，ΔCfLysM2侵染草莓葉片后，下調基因僅占所有差異表達基因的13%（6/47），分別在環境適應、翻譯、輔助因子和維生素代謝、聚糖生物合成和代謝類別中富集，其中，聚糖生物合成和代謝僅富集到下調基因，說明CfLysM2在果生炭疽菌侵染過程中除了廣泛抑制次生代謝、氨基酸代謝之外，還能一定程度上激活特異性次生代謝通路。

2.8?差異基因熒光定量PCR驗證

選取6個差異表達基因對轉錄組結果進行RTqPCR驗證，包括2個顯著差異表達的次生代謝

相關基因FLS和POX12。其他4個基因分別為：β1，3葡聚糖酶基因（βGlu），是一種主要存在于植物

中的水解酶，能催化真菌細胞壁的重要成分葡聚糖的水解;WRKY70和WRKY53是WRKY轉錄因子家族的成員，在植物抗病免疫的茉莉酸和水楊酸信號傳導中發揮重要作用;CYP（71B34like）是細胞色素P450酶超家族成員之一，細胞色素P450酶廣泛存在于哺乳動物、植物、真菌等中，參與多種代謝途徑，合成的許多次生代謝物能夠保護植物應對各種生物和非生物脅迫。結果（圖7）顯示，選取的6個差異基因的表達情況與轉錄組測序結果一致，說明轉錄組分析結果可靠。

3?結論與討論

本研究在前期工作基礎上，研究了果生炭疽菌侵染草莓過程中上調表達的候選效應子CfLysM2的致病功能。CfLysM2效應子具有典型的信號肽序列和2個LysM保守結構域，不含任何跨膜結構域。同源性比對分析發現，不同病原菌中的LysM具有一定的同源性，但差異較大。CfLysM2與同屬的膠孢炭疽菌的LysM的一致性最高，為99%，與不同種屬LysM一致性相對較低，僅有60.1%～64.4%。根據同源重組成功獲得了CfLysM2的突變菌株ΔCfLysM2及回補菌株CfLysM2c。致病性測定結果表明，ΔCfLysM2的致病力與野生型菌株和回補菌株CfLysM2c相比明顯減弱。RTqPCR檢測結果顯示，該基因在果生炭疽菌侵染草莓葉片后的24?h相對表達量最高，推測CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染的早期階段發揮作用。取野生型菌株和ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h的樣本進行轉錄組測序，共篩選出109個差異表達基因。GO分析顯示，差異基因顯著富集在催化活性、代謝過程和結合3個類別，其中，次生代謝物生物合成和氨基酸代謝通路中上調基因顯著富集。

植物次生代謝由初生代謝衍生而來，初生代謝合成碳水化合物、核酸、?蛋白質等初生代謝產物。初生代謝產物在特定酶的作用下轉化為次生代謝產物，這一過程被稱為次生代謝。次生代謝產物多是分子結構較復雜的化合物，如萜類化合物、抗生素、生物堿等［23］。盡管次生代謝產物是植物非必需小分子化合物，但其是植物與環境中生物和非生物因素長期共存進化的結果。在應對環境脅迫、病原微生物侵染等過程中起重要作用［2425］。本研究中，轉錄組學KEGG分析結果顯示，CfLysM2基因敲除后次生代謝物質的生物合成、萜類和聚酮類化合物代謝是上調轉錄本最多的兩大類別，說明CfLysM2可能在抑制植物次生代謝生物合成過程中發揮關鍵作用。

在所有植物次生代謝產物中，黃酮類化合物是植物抵御外界惡劣環境、微生物侵害等過程中形成的一大類次生代謝產物，目前已發現4?000多種黃酮類化合物，分為黃酮醇、黃酮、異黃酮和花色素苷［26］。其中，黃酮醇的生物合成過程中需要苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4羥化酶（C4H）、4香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHs）、黃酮醇合成酶（FLS）等多個酶的共同參與。FLS是黃酮醇生物合成最后一步的關鍵限速酶［27］。本研究中，轉錄組差異表達基因中上調倍數最高的是黃酮醇合成酶基因（233倍），表現為極其顯著上調，說明CfLysM2可能通過抑制黃酮醇合成酶活性，抑制次生代謝產物黃酮醇的合成，幫助真菌侵染。

除了次生代謝相關基因之外，植物過氧化物酶（peroxidase，POX）也被廣泛認為在植物應對病原侵染過程中發揮關鍵作用，POX是病原菌侵染寄主植物后誘導的一類病原相關（pathogenesisrelated，PR）蛋白，除此之外，POX還在激素調節、活性氧代謝、細胞壁形成過程中發揮關鍵作用［28］。本研究鑒定到的差異表達基因中除了黃酮醇合成酶，還鑒定到POX12基因顯著上調（191倍），由于POX在細胞中發揮多種功能，因此CfLysM2調控POX的具體機制有待進一步研究。

本研究運用轉錄組學技術，對野生型菌株和突變菌株ΔCfLysM2分別侵染后草莓葉片的轉錄組進行比較，發現CfLysM2的敲除導致宿主代謝途徑，尤其是次生代謝物生物合成通路的激活，說明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓過程中通過靶向黃酮醇合成酶、7甲基黃嘌呤合成酶等基因，抑制植物次級代謝產物合成及其介導的抗真菌免疫，保證其順利侵染。該結果為揭示CfLysM2機理及對果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理論基礎。

參考文獻

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（責任編輯：楊明麗）