過表達和敲除NtabNAC087基因對煙草響應干旱脅迫的影響

王世澤 劉 杰 楊志曉 曹領改 劉 勇， 宗 儀林小虎 余世洲，

（1河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北 秦皇島 066004； 2貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081；3河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002； 4江蘇中煙工業有限責任公司，江蘇 南京 210000）

干旱是抑制作物生長、發育和產量的主要非生物脅迫之一［1］。作物遭受干旱脅迫后生長受到抑制，可導致作物減產乃至絕收［2］。前人通過對擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativaL.）NAC 基因家族進行綜合分析發現，按照蛋白結構相似度和進化關系，可以將NAC 基因劃分為兩大類，共18 個亞組［3］。其中AtNAC3 和ATAF 亞組基因多被報道與干旱、鹽害、冷害等逆境脅迫應答相關［4］。除了這兩個亞組基因，NAP、NAM 和OsNAC3亞組也有少數基因具有響應逆境脅迫的功能［5］。

Tran 等［6］利用基因表達譜芯片發現，擬南芥AtNAC3 亞組成員基因ANAC019、ANAC055和ANAC072/RD26遭受干旱或鹽脅迫后，基因表達顯著上調，且構建的過表達植株在干旱脅迫下表現出抗旱性，證實了上述3 個基因能夠響應干旱或鹽脅迫。隨后NAC 基因家族AtNAC3亞組成員基因或同源基因在多個物種中被證實具有抵御干旱脅迫的功能。如在玉米（Zea maysL.）中過表達ZmNAC49基因，能夠影響氣孔發育，降低氣孔密度，從而提高玉米的耐旱性［7］。通過在擬南芥中異源表達玉米ZmSNAC13基因能夠顯著提高擬南芥植株的耐旱性［8］。在小麥（Triticum aestivumL.）中，通過正向遺傳學和基因調控網絡分析，發掘出小麥干旱響應基因TaSNAC8-6A，且證實了其具有抗旱功能［9］。在茄科物種NAC 基因家族相關研究中，證實了過表達馬鈴薯（Solanum tuberosum）StNAC053和番茄（Solanum lycopersicum）SlNAC6基因，可使植株對干旱脅迫處理的耐受性顯著提高，同時維持較低的水分損失率和氧化損傷程度，以及較高的脯氨酸含量和抗氧化酶活性［10］。另外在木薯（Manihot esculentaCrantz）和芹菜（Apium graveliensL.）研究中，分別發現擬南芥ANAC072/RD26同源基因MeRd26［11］和AgNAC63［12］受干旱脅迫誘導后表達量顯著上升，具有抗旱作用。

本研究前期通過生物信息學手段篩選到與擬南芥ANAC072/RD26基因的同源煙草（Nicotiana tabacumL.）基因NtabNAC087［13］，且通過基因表達譜數據發現干旱脅迫下表達量上調。為了進一步鑒定NtabNAC087基因是否參與干旱脅迫應答，本研究以具有參考基因組序列的主要栽培煙草品種K326為試驗材料，通過遺傳轉化、CRISPR/CAS9 技術及煙草生育期調控技術［14］，構建NtabNAC087基因的過表達和基因敲除純合陽性株系（T2），并在此基礎上，觀測不同煙草株系材料在遭受干旱脅迫后植株表型和基因表達情況，以期為進一步研究NtabNAC087的分子調控網絡及育種利用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通煙草品種K326（野生型/對照材料）種子，遺傳轉化過程中使用的大腸桿菌DH5α、Top10 感受態細胞、農桿菌EHA105菌株和載體pBWA（V）HS均由貴州省煙草科學研究院保存并提供，前期研究初步篩選得到的NtabNAC087基因（Nitab4.5_0000662g0120.1）［13］序列在茄科基因組網站（https：//solgenomics.net/）下載得到。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草NtabNAC087基因的克隆及轉基因植株的構建 利用總RNA 小量制備試劑盒（愛思進，杭州）提取煙草總RNA，并用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（全式金生物，北京）進行RNA 反轉錄。使用Primer6 軟件［15］對NtabNAC087基因進行PCR 擴增引物設計（引物信息見表1）。PCR體系為20 μL：DNA 3 μL，2× Taq Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1正反引物各1 μL，蒸餾水補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃終延伸7 min。選擇1%瓊脂糖凝膠電泳，并用DNA 凝膠回收試劑盒（愛思進，杭州）回收目的片段，隨后將回收的NtabNAC087基因片段與pBWA（V）HS 載體片段利用T4 連接酶進行連接。遺傳轉化流程參考文獻［16］。

表1 所用引物序列Table 1 The sequence of the primers used in this experiment

通過CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在線網站設計CRISPR/Cas9 敲除sgRNA，基因敲除載體構建及遺傳轉化委托武漢伯遠生物科技有限公司完成。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的T0代植株是否為陽性，對陽性植株進行早花處理［17］，在貴州省煙草科學研究院人工氣候室進行連續加代，得到T2代材料，挑選基因表達量較高的過表達植株及編輯位點純合的編輯植株做為后續的試驗材料。

1.2.2 干旱脅迫試驗設計 將NtabNAC087基因過表達植株、編輯植株和野生型K326 種子放入含有20%PEG6000的MS固體培養基中進行種子萌發試驗，觀察種子萌發10 d后根的生長情況。

苗期試驗處理流程：將種子放入含Hoagland 營養液的培養皿中進行催芽，待發芽后移栽到泥炭土中進行培養，在16 h 光照/8 h 黑暗、28 ℃/23 ℃培養箱內生長，設置干旱處理組，自然脅迫（移栽成活后不澆水）處理15 d，觀察并記錄植株的萎蔫程度，對照組煙草植株正常補充水分。

1.2.3 數據調查 待對照組煙草植株播種后45 d時，利用SU8010掃描電鏡（日立，日本）對其葉片組織氣孔形態進行觀察，利用Nano Measure 1.2 軟件統計氣孔密度、氣孔長度和氣孔寬度，每個樣品設置5 個生物學重復。待煙草植株播種后45 d時，將其移入Hoagland營養液中進行水培，60 d時進行20% PEG6000模擬干旱處理。在干旱處理0、1、3、6 和12 h 時分別對植株葉片取樣，液氮速凍，-80 ℃保存。采用脯氨酸（proline，Pro）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測定不同材料中各成分的酶活及含量。以煙草Actin基因作內參基因，使用TB Green?Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，大連）進行qRTPCR（quantitative real-time PCR）測定基因的表達量（所用引物見表1）。反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，TB Green Premix DimerEraser 10 μL，RoxⅡ0.4 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.6 μL，用蒸餾水補至20 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，40個循環。設置3次生物學重復。

1.3 數據分析

使用Microsoft Excel 2007 軟件進行數據計算和圖表繪制，使用SPSS 19.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 NtabNAC087的基因過表達及基因敲除

NtabNAC087基因的開放閱讀框長度為1 766 bp，共編碼342 個氨基酸，分子量為39.046×103，含有NAC超家族結構域，屬于AtNAC3 亞族成員。共獲得24 株T0代過表達株系材料，結果表明96%的過表達植株為陽性（圖1-A）。對陽性植株進行連續早花處理后得到T2代材料，篩選得到5 個穩定株系（oeNAC087-1～oeNAC087-5）。

圖1 NtabNAC087的基因過表達及基因敲除檢測結果Fig.1 Results of gene overexpression and gene knockout detection of NtabNAC087

對NtabNAC087基因結構進行分析可知含有4 段編碼序列（coding sequences，CDS）區（圖1-B），將第一個外顯子區5′→3′方向118～137 bp 區域的20 bp 堿基序列為靶點編輯位點進行NtabNAC087基因敲除，序列（5′→3′）為GACTTCTCTATGCAAATCATTGG。共得到10 株T0代編輯株系材料，進行加代后得到5 個穩定株系（geNAC087-1～geNAC087-5）。

分別對不同株系的基因表達量進行測定。待T2代材料生長45 d左右時，對NtabNAC087基因表達量進行檢測，過表達植株中NtabNAC087基因表達量均顯著高于對照K326，編輯植株中有3個株系NtabNAC087基因表達量與對照組存在顯著差異（圖1-C）。其中過表達株系oeNAC087-5的基因表達量最高是對照的14倍左右；基因編輯株系geNAC087-5 的基因表達量最低，是對照的0.27 倍，選擇這兩個株系做后續的干旱脅迫及自然干旱相關試驗。同時對基因編輯株系geNAC087-5提取DNA后進行測序，發現其編輯位點存在胸腺嘧啶T堿基的插入，導致NtabNAC087基因移碼突變（圖1-D）。

2.2 苗期植株表型鑒定

由圖2-A 可知，在PEG6000 干旱脅迫處理下，種子在萌發階段根長的發育存在差異，其中編輯植株的根最短，過表達植株的根相比對照組較長。由圖2-B可知，苗期進行自然干旱處理后，3 種植株葉片都表現出不同程度萎蔫，基因敲除植株葉片萎蔫程度最大，過表達植株萎蔫程度最小，由此推測，NtabNAC087基因可以提高煙草的抗旱性。同時，對3 種煙草植株葉片進行掃描電鏡觀察，在同一面積內對氣孔密度進行統計，結果如圖2-C 所示。對照K326植株的平均氣孔密度為12 個，過表達植株為18 個，編輯植株為12 個，過表達植株的氣孔密度高于其他兩組。通過對保衛細胞進行觀察，發現對照K326 植株細胞較為飽滿，細胞外露，而過表達植株細胞較小且在氣孔內嵌，編輯材料的氣孔形態介于兩者之間（圖2-D）。

由圖3 可知，過表達植株葉片氣孔長度相比于對照組及編輯植株氣孔長度顯著較短，對照K326與編輯材料無顯著差異；過表達植株葉片寬度最短，對照組其次，編輯植株葉片氣孔寬度最長，三者之間均存在顯著差異。氣孔長度與氣孔寬度相乘表示氣孔的大小。因此，過表達植株的氣孔小于對照K326，而編輯植株的氣孔大于對照K326。

圖3 氣孔長寬對比圖Fig.3 Comparison of pore length and width

2.3 干旱脅迫下酶促反應的變化

由圖4-A 可知，在干旱脅迫處理下，3 種材料的SOD 活性都表現出隨處理時間延長而升高的趨勢，且過表達植株在所有時間段內SOD 活性均顯著高于其他植株，在12 h時達到最高，為1 553.96 U·g-1；編輯植株在0、1、3 和6 h 時活性顯著高于對照K326，在12 h時與對照K326無顯著差異。

圖4 抗氧化酶活性Fig.4 The activities of the antioxidant enzymes

由圖4-B可知，在干旱脅迫處理下，3種材料中CAT活性均表現為先增加后減少再增加的趨勢。其中，在0和1 h時3種植株中CAT活性無顯著差異；在3 h時過表達植株顯著高于其他材料，為753.36 μmol·min-1·g-1，編輯植株顯著低于其他材料；在6 h時過表達植株活性顯著高于其他材料，編輯植株與K326 之間無顯著差異；在12 h 時3 種材料無顯著差異且均達到最高值。結果表明，過表達植株在短期脅迫下，CAT 活性在3 h 前無顯著變化，3～6 h 較對照組顯著升高，12 h 時無明顯變化。

由圖4-C 可知，在干旱脅迫處理下，MDA 含量整體為先上升后下降趨勢，在0 h 時3 種材料之間無顯著差異；1 和3 h 時過表達材料顯著低于其他材料，編輯植株顯著高于其他材料；6 h 時3 種材料無顯著差異；12 h 時編輯材料與過表達植株顯著低于K326。過表達植株在整個處理過程中MDA 含量較為穩定，K326和編輯植株均在1 h時達到最高值。

由圖4-D 可知，在干旱脅迫處理下，Pro 含量隨時間變化一直升高，在1 h 時過表達植株Pro 含量較對照組不存在顯著差異；在0、3、6 和12 h 時過表達植株顯著高于K326，編輯植株顯著低于K326，說明在脅迫后期NtabNAC087基因對Pro 含量的影響較為明顯，提高了植株的抗旱性。

2.4 基因表達量分析

通過qRT-PCR 對NtabNAC087基因表達量進行測定，得到結果如圖5 所示。隨著處理時間延長，植株中基因的表達量均呈現為先上升后下降的趨勢，并且過表達植株在0、1、6 和12 h 時NtabNAC087基因表達量顯著高于K326，編輯植株在0、1、3 和6 h 時基因表達量顯著低于K326，過表達和對照K326 植株在6 h 時基因表達量達到最高，而編輯植株在3 h時達到最高。

圖5 NtabNAC087基因表達量Fig.5 The expression of NtabNAC087 gene

3 討論

氣孔作為控制水分和CO2進出植物的重要途徑，氣孔的大小、密度和數量等指標可以用于評估植株的抗旱能力［18］。氣孔的打開和關閉是由保衛細胞膨脹的變化引起的，保衛細胞膨脹時氣孔打開，保衛細胞松弛時氣孔關閉，干旱脅迫下會誘導氣孔關閉［19］。干旱和低溫都會導致植物水分狀況失衡，并誘導促進氣孔關閉的脫落酸（abscisic acid，ABA）合成。因此，氣孔關閉是對干旱和寒冷的適應性反應［20］。在本研究中通過對過表達和基因編輯NtabNAC087基因株系與K326野生型植株的氣孔表型進行觀察，發現過表達植株相較于編輯和K326 植株中氣孔數量較多，氣孔較小。賈東峰［21］研究發現蘋果中過表達MdNAC1基因會降低氣孔大小，提高氣孔密度，與本研究結果相符。氣孔密度的增加及氣孔大小的減小可以保持或改善總氣孔的面積，同時也提供了更短的擴散途徑，可能會改善氣體的交換［22］。水稻中NAC家族OsNAC1基因可以促進葉片氣孔關閉，減少水分損失，從而增強過表達植株的耐旱性和耐鹽性［23］，同樣證實了NAC 基因家族可以參與氣孔的調節活動。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生是植物在正常和脅迫條件下的常見現象，并且在非生物脅迫逆境中，ROS 的產生將可能超出抗氧化防御系統的能力［24］。若植物體內ROS 的動態平衡被打破，植物會通過酶抗氧化系統來維持體內ROS平衡［25］。在干旱脅迫下，SOD和CAT活性上升，從而降低膜脂過氧化損傷程度，提高腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）活性，緩解干旱光合生理的傷害［26］。本研究中SOD活性隨處理時間的延長逐漸升高，且過表達植株的SOD 活性與K326存在顯著差異。說明干旱脅迫下，過表達植株表現出更好的耐旱性。

ROS的積累，包括作為信號轉導分子的H2O2，也可能導致廣泛的細胞損傷和光合作用抑制［27］。在干旱脅迫下，植物會發生原生質脫水，引起細胞膜結構的變化及膜上細胞的失活［28］。MDA 是膜脂過氧化的最終產物，可作為氧化脂質損傷標志物［29］，其含量可以用來評估植株受到的氧化損傷程度。本研究通過對轉基因純合材料的驗證，NtabNAC087基因表達量的檢測及干旱脅迫處理條件下煙草植株各種生理指標的測定，驗證NtabNAC087基因是否參與干旱脅迫的響應功能。結果表明，CAT活性在3～6 h內過表達植株較其余材料存在顯著差異，MDA 含量在1～3 h內差異較為明顯，推測NtabNAC087基因可能在干旱脅迫前期對CAT 活性和MDA 含量存在影響，其中3 種材料的Pro 含量、SOD活性存在差異，都為上升趨勢且在12 h時差異顯著，可能對干旱脅迫后期產生影響。Pro 作為滲透調節物質發揮作用［30］，當植株受到的干旱脅迫越為嚴重，其后期含量就越高。通過3種材料的橫向比較，發現面對相同程度的干旱脅迫，過表達植株中Pro 含量明顯升高，Pro含量越高則代表其抗旱能力越強。同作為茄科植物的番茄，過表達SlNAC6基因可顯示出對干旱脅迫的耐受性大大增強，同時表現出較高的Pro含量和抗氧化酶活性［10］，這與本研究結果相吻合，證明了NtabNAC087基因與煙草抗旱性相關，過表達該基因后可提高煙草的抗旱性。

在基因表達量分析結果中，CRISPR/Cas9 技術使NtabNAC087基因表達量下降，與李兆偉等［31］的研究結果相似。本研究還發現NtabNAC087基因表達量的變化較為明顯，整體表現為先上升后下降，且在6 h時達到最高，與白戈等［32］研究轉錄因子在干旱脅迫下的表達量呈先增后減趨勢的結果相似。由此推測NtabNAC087基因的抗旱能力可能存在閾值，過表達植株的閾值提高，從而增強了植株的抗旱性。

4 結論

通過克隆煙草中與擬南芥RD26基因同源的NtabNAC087基因，進行過表達及編輯植株的構建，在PEG6000模擬干旱脅迫下研究NtabNAC087基因功能，發現煙草NtabNAC087基因過表達植株通過改變植株葉片氣孔、生理指標及相關基因的表達，增強了植株的抗旱性。證明NtabNAC087基因作為轉錄因子參與干旱脅迫的應答，且過表達NtabNAC087基因可以使植株獲得更強的耐旱性。