急性肺損傷大鼠模型評價

李夢醒，劉 濤，王曉偉，金 海

（中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院胸外科，上海 200433）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是由多種直接或間接因素引起的一系列肺部改變和嚴重低氧血癥,死亡率和致殘率很高[1-3],是重癥監護室的常見疾病。引起ALI 的病因及高危因素很多,其中肺部感染是主要原因[4-5],不同因素所致的ALI 病程及預后不同。ALI 病理生理機制包括炎癥反應失調以及肺泡-毛細血管屏障破壞,在組織學上表現為中性粒細胞型肺泡炎、肺泡內透明膜沉積、微血管血栓形成等[6-7],ALI 發病機制尚未完全闡明,選擇合適的動物模型對研究ALI 早期發病機制及治療方案至關重要。

動物模型種類繁多,嚙齒類動物體型小、成本低、遺傳背景單一,操作方便[8-9],常用來研究ALI。通常采用氣管、腹腔、尾靜脈注入具有導致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）潛能的化學物質如脂多糖、油酸、海水等建立ALI 動物模型,此外還有創傷性和吸入性動物模型[10-13]。由于小鼠模型誘導機械通氣和采集血液樣本較困難,不適合長期研究[11],因此本次實驗選擇大鼠氣管內注入脂多糖和海水制備兩種ALI 模型,選擇這兩種模型是因為它們具有高度的可重復性,可以誘發強中性肺泡炎和肺泡毛細血管膜破壞,易于滴定肺部炎癥程度,并可以評估ALI 的早期和轉歸階段,有助于我們對ALI 病理生理機制的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠28 只,體重200～300 g,購于上海市生命計劃科學研究所[SPF 級,合格證編號:20180006036523,許可證號:SCXK（滬）2018-0006]。飼養于長海醫院動物實驗中心[使用許可證:SYXK（滬）2020-0030],常規喂養1 周后開始實驗。

1.2 實驗試劑 脂多糖（LPS）（Sigma 公司）:溶于無菌生理鹽水,配制成5 mg/mL 溶液;海水:按照我國東南沿海海水主要成分配制,NaCl 26.52 g/L,MgCl22.45 g/L,MgSO43.31 g/L,CaCl21.14 g/L,KCl 0.73 g/L,NaHCO30.202 g/L,NaBr 0.083 g/L,滲透壓濃度1 250～1 350 mmol/L,pH 8.2,比重1.05～1.06。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠ALI 模型建立:將28 只大鼠隨機分為空白對照組（Control 組）4 只、脂多糖組（LPS 組）及海水淹溺組（SW 組）各12 只。實驗前禁食8 h,自由飲水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg,待肢體疼痛反射消失后,仰臥在手術臺上并固定頭與四肢。頸部脫毛暴露皮膚,75%酒精消毒,正中切口1 cm 暴露氣管。以1 mL 注射器穿刺氣管,Control 組不予處理,LPS 組和SW 組按2 mL/kg 劑量于氣管內分別勻速緩慢注入LPS 溶液和海水,3 min 內注射完畢。注畢后立即將大鼠直立1 min,防止大鼠嗆咳。一旦大鼠出現呼吸心跳暫停,立即行心臟按壓并機械通氣,防止窒息死亡。逐層縫合頸部切口,電熱毯復溫加速大鼠蘇醒。待大鼠蘇醒后正常飼養。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組隨機各抽取4 只大鼠,麻醉后取靜脈血、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺組織,進行后續實驗。Control 組4只大鼠一次性進行相同實驗。

1.3.2 血清IL-1、IL-6、TNF-α 濃度測定:分別于建模后6 h、12 h、24 h 抽取大鼠下腔靜脈血3 mL,常溫靜置4～6 h,離心取上清液,按ELISA 試劑盒說明書測定血清IL-1、IL-6、TNF-α 濃度。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）IL-1、IL-6、TNF-α 濃度測定:夾閉左肺門,以3 mL 無菌生理鹽水反復沖洗右肺獲取肺泡灌洗液2 mL,離心取上清液,采用ELISA 試劑盒測定IL-1、IL-6、TNF-α 濃度及總蛋白濃度。

1.3.4 肺組織濕重/干重比值:取大鼠左肺下葉,吸水紙擦拭組織表面稱重為濕重,脫水后烤箱烘干,反復稱量至重量不再發生變化為干重,計算濕重/干重比值。

1.3.5 病理組織HE 染色:取左肺上葉,PBS 液沖洗后制作病理切片,行HE 染色,觀察肺組織病理形態學改變。

1.4 統計學處理 應用SPSS 14.0 統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以±s 表示,單因素兩組間比較,使用獨立樣本t 檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）;若方差齊兩組間比較采用LSD 檢驗;若方差不齊則用Dunnett’s t3進行校正。P＜0.05 為差異有統計學意義。應用GraphPad Prism 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 肺組織損傷及病理改變 HE 染色切片顯示,Control 組大鼠肺組織肺泡壁較薄,相對完整,偶見肺泡內巨噬細胞,中性粒細胞極少見（圖1A、1B）。造模后6 h LPS 組和SW 組大鼠可見肺組織片狀損傷,中性粒細胞聚集,仍有部分肺組織正常,LPS 組和SW組之間未見明顯差異（圖1C、1F）。造模后12 h LPS組和SW 組均可見較明顯的肺泡斷裂、間質輕微增厚以及較多中性粒細胞聚集（圖1D、1G）。造模后24 h LPS 組和SW 組均可見明顯的肺泡萎陷、破裂,肺泡壁及間質增厚,中性粒細胞滲出及巨噬細胞增多,并伴有纖維蛋白鏈沉積和透明膜形成,表現為急性肺損傷病理學改變（圖1E、1F,圖2）。

圖1 各組肺組織HE 染色病理學表現（200×）

圖2 急性肺損傷組織（400×）

2.2 各組血清及肺泡灌洗液中IL-1、IL-6、TNF-α濃度比較 造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組血清IL-1 濃度高于Control 組,造模后6 h LPS 組血清IL-6 及TNF-α 濃度高于Control 組,SW 組IL-6濃度高于Control 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組BALF中TNF-α 和IL-6 濃度高于Control 組,造模后12 h、24 h LPS 組BALF 中IL-1 濃度高于Control 組,造模后24 h SW 組BALF 中IL-1 濃度高于Control組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。若同時考慮血清和肺泡灌洗液中3 種炎癥因子的表達情況,LPS 組在12 h 便出現了3 種炎癥因子同時具有統計學意義的升高,而SW 組則是24 h 才同時出現差異有統計學意義。見表2。LPS 組與Control 組比較,血液或是BALF 中,LPS 組促炎因子濃度均高于SW 組,但僅僅是血液中TNF-α 在6 h 節點差異有統計學意義,BALF 中IL-6 在6 h、12 h 節點差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

表1 各組血清中炎癥因子濃度比較 pg/mL

表2 各組BALF 中炎癥因子濃度比較 pg/mL

圖3 LPS 和SW 兩組大鼠血清及BALF 中炎癥因子變化（*P＜0.05）

2.3 各組肺泡灌洗液中總蛋白含量比較 肺泡上皮和血管通透性增加引起血管外蛋白積累,肺泡灌洗液中總蛋白含量可反映毛細血管屏障破壞的程度。造模后6 h、12 h、24 h 3 組肺泡灌洗液中總蛋白含量比較,差異均無統計學意義（P＞0.05）,見圖4。

圖4 各組大鼠BALF 中總蛋白含量

2.4 各組大鼠肺組織濕重/干重比較 計算肺組織濕重/干重比是測量肺水量的粗略方法,間接反映肺毛細血管和肺泡上皮細胞滲透率改變。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組及SW 組肺組織濕重/干重比大于Control 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。造模后各時間點LPS 組肺組織濕重/干重比大于SW 組,但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織濕重/干重比較

3 討論

ALI 作為死亡率很高的危重癥,對其發病機制的研究任重而道遠。而動物模型的建立與評估在基礎研究中起著不可替代的作用。目前已建立多種ALI動物模型,但尚不完全符合人類ALI 發病特點,盡管如此,人類對疾病的認識以及藥物作用機制研究依然離不開現有的動物模型。鑒于美國胸科委員會提出的肺損傷評價標準[14],我們根據實驗室條件以及普適性選擇相應指標及測量方法來評估ALI 動物模型。（1）通過組織切片HE 染色尋找肺組織損傷證據;（2）測定BALF 中總蛋白含量及肺組織濕重/干重比評估肺泡毛細血管屏障改變;（3）測定血清及BALF 以及血清中促炎癥細胞因子濃度評估肺部炎癥反應。

本研究選擇最方便且準確性最高的氣管穿刺入路,LPS 和海水建立的大鼠ALI 模型代表缺氧和內毒素兩種因素導致的肺損傷,可以覆蓋臨床上大多直接肺損傷類型。我們發現這兩種模型均可見明顯的肺組織損傷和炎癥反應,與已知的ALI 可能發生機制吻合。本研究結果顯示,LPS 組和SW 組大鼠血清和BALF 中炎癥因子水平以及肺組織濕重/干重比均顯著高于Control 組,且具有統計學意義。而肺泡灌洗液中蛋白質含量在3 組之間差異無統計學意義,這或許是因為蛋白質的滲出會滯后于炎癥介質的出現和肺水腫的形成。而LPS 與SW 組比較,血液或是BALF 中,LPS 組3 種炎癥因子濃度均高于SW組,但僅僅是血液中TNF-α 在6 h 節點差異有統計學意義,BALF 中IL-6 在6 h、12 h 節點差異有統計學意義,并不能說明LPS 組的炎癥反應比SW 組重。但是若同時考慮血漿和肺泡灌洗液中3 種炎癥因子的表達情況,LPS 組在12 h 便出現了3 種炎癥因子同時具有統計學意義的升高,而SW 組則是24 h 才出現該現象。因此,通過本實驗可知,LPS 及SW 誘導的動物模型均可模擬ALI 疾病狀態,但其炎癥因子升高的時間點各有不同,LPS 誘導的ALI 比SW誘導的ALI 炎癥反應發生的更迅速。

綜上所述,本研究采用的LPS 和海水誘導的ALI 動物模型均具有普適性,可重復性強,簡單直接等優點,非常適用于條件有限的實驗室研究。且本研究對兩種肺損傷動物模型病理生理的改變進行了多方面的比較與評價發現,LPS 及SW 均可成功誘導ALI,但其炎癥因子升高的時間點各有不同,如血液中或是BALF 中,LPS 組大鼠TNF-α 的濃度最先出現有意義的升高,而在SW 組中卻是IL-6 率先出現具有統計學意義的升高,且LPS 誘導的ALI 比SW誘導的ALI 炎癥反應發生的更迅速。這對我們后續疾病的研究具有指導意義,如動物模型選擇、實驗設計、藥物干預時間、標本獲取時間、不同機制研究等。