基于灰色關聯度法的藥用螞蟻品質探析

朱瑩瑩，郭巧生*，趙開軍，于尚平

1.南京農業大學 中藥材研究所，江蘇 南京 210018；

2.南京中山制藥有限公司，江蘇 南京 210046

螞蟻是蟻科（Formicidae）昆蟲的總稱，是陸地上分布最廣泛、種類和數量最多的社會性昆蟲，除了南北極和高山雪線以上的地區均有分布[1]。螞蟻不僅具有經濟價值和生態意義，部分品種的螞蟻還具有重要的食藥用功能。我國已有2000 多年的螞蟻藥用歷史，且藥用習慣表現出典型的地域差異。漢代民間治療筋骨軟弱的“金剛丸”即為螞蟻粉蜜制而成的藥丸。明代李時珍[2]在《本草綱目》中詳細記載了螞蟻的習性、毒性和食療作用。清代趙學敏[3]的《本草綱目拾遺》中記載山螞蟻窠可治“久不收口之爛瘡、刀傷出血、禿瘡”等，山螞蟻可“合壯藥”，即認為螞蟻屬于補益類藥材。螞蟻味咸、酸，性平，一般認為歸肝、腎經，具有扶正固本、補腎壯陽、祛瘀通絡、解毒消腫之功效，用于腎虛陽痿、風濕痹癥、疔毒腫痛、慢性肝炎及某些癌癥的輔助治療。據統計，目前我國已經有13 個省（自治區）頒布了螞蟻藥材相關的地方標準，其中收載的藥用螞蟻品種絕大部分是雙齒多刺蟻Polyrhachis divesSmith（過去一直被稱為擬黑多刺蟻或鼎突多刺蟻P.vicinaRoger。1991 年，王常祿等[4]研究證實兩者乃是同物異名，并獲得國際蟻學界認可。根據定名先后規則，本研究沿用“雙齒多刺蟻P.divesSmith”這一中文名與拉丁名），藥材商品名通常稱為黑螞蟻。前期市場調查發現，葉形多刺蟻P.lamellidensSmith也被作為黑螞蟻藥材基原之一，其在我國貴州等地區具有非常廣泛的藥用。2 種藥用螞蟻均屬于多刺蟻屬（Polyrhachis），外觀形態特征極為相似，藥用及保健范圍也類似，因此都被作為黑螞蟻藥材，并不加以區分。

灰色關聯度分析（GRA）是灰色理論的基本內容，是一種針對模糊系統研究的有效手段。基于中藥成分與中藥質量是一種灰色關系的認識，運用GRA 評價中藥質量具有一定理論基礎[5]。目前GRA已經在許多動物類藥材質量評價中得到應用，如蜈蚣[6]、地龍[7]等。本研究以2 種基原、12 個不同產地的藥用螞蟻為研究對象，以藥用螞蟻中5 類主要藥效成分的含量為指標，建立GRA 模型，以期為不同基原與產地的螞蟻藥材資源開發與利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

12 批藥用螞蟻樣品信息見表1，其種屬均由廣西師范大學陳志林教授鑒定，分別為雙齒多刺蟻Polyrhachis divesSmith 和葉形多刺蟻P.lamellidensSmith。

表1 藥用螞蟻藥材樣品來源信息

鹽酸（分析純，批號：160725196H，國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸銀（分析純，批號：20121101，科亞精細化工有限公司）；錳（Mn，1000 mg·L–1，批號：GSB 04-1736-2004）、鐵（Fe，1000 mg·L–1，批號：GSB 04-1726-2004）、銅（Cu，1000 mg·L–1，批號：GSB 04-1725-2004）、鋅（Zn，1000 mg·L–1，批號：GSB 04-1761-2004）均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸（分析純，批號：20180718，上海凌峰化學試劑有限公司）；濃硫酸（分析純，批號：210419047J，南京化學試劑股份有限公司）；無水乙醇（分析純，批號：20210427）、氫氧化鈉（分析純，批號：20210406）、硼酸（分析純，批號：20210322）均購于廣東光華科技股份有限公司；對照品甲酸（色譜純，批號：F809712）、甲酸乙酯（分析純，批號：E809008）均購于上海麥克林生化科技有限公司；水為超純水。

1.2 儀器

M82 型中藥磨粉機（山東九陽股份有限公司）；BMS-120.4 型萬分之一電子天平（上海卓精電子科技有限公司）；MFLC 16/12 B 型馬弗爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水系統（美國Millipore 公司）；iCAP Qc 型電感耦合等離子體質譜儀、Trace GC Ultra 型氣相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；ETHOS UP 型微波消解儀（意大利Milestone 公司）；KT8400 型凱氏定氮儀、DT220 型消化爐（丹麥福斯公司）；L-8900 型氨基酸分析儀（日本Hitachi公司）。

2 方法

2.1 雜質、水分和灰分測定

參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）通用技術要求[8]測定。

雜質測定：按照通則2301 雜質檢查法。取供試品約25 g，用肉眼或借助放大鏡觀察，將樣品中的泥沙、碎石、植物枯葉及種子等雜質揀出，同時注意除去供試品中混入的其他昆蟲。將雜質稱定質量，計算其含量。

水分測定：按照通則0832 第三法測定水分含量。取供試品粉末1 g，置于已在供試品同樣條件下干燥并稱定質量的稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋，放入真空干燥箱中，抽氣減壓至2.67 kPa（≈20 mmHg）以下，并持續抽氣30 min，室溫放置24 h 后打開活塞，待內外壓一致，關閉活塞，打開干燥器，蓋上瓶蓋，取出稱量瓶迅速精密稱定質量，計算供試品中的含水量。

總灰分及酸不溶性灰分測定：按照通則2302 測定總灰分、酸不溶性灰分含量。取供試品粉末2 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質量（精確至0.01 g），緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化后，逐漸升高溫度至550 ℃，使完全灰化并至恒重。根據供試品殘渣質量，計算其總灰分的含量。取所得的灰分，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用5 mL 熱水沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼直至恒重。根據供試品殘渣質量，計算其酸不溶性灰分的含量。

2.2 4種主要微量元素測定

參照《中國藥典》2020 年版（四部）通則2321項下微波消解電感耦合等離子體-質譜法（ICP-MS）測定藥用螞蟻樣品中Mn、Fe、Cu、Zn 元素含量[8]。用質量濃度均為1000 mg·L–1的Mn、Fe、Cu、Zn標準母液，以5%硝酸為介質，配成0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·L–16 個質量濃度梯度的混合對照品溶液，過0.22 μm水系微孔濾膜，即得對照品溶液。稱取供試品粉末0.2 g（精確至0.000 1 g），置消煮管中，精密加入硝酸5.0 mL，微波消解儀消煮30 min。將消煮液轉移至50 mL 量瓶中，并用純水洗滌消煮管2～3 遍，最后用純水定容至刻度。用0.22 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL 注入電感耦合等離子體質譜儀，測定，即得。

2.3 浸出物、總氮和蟻酸含量測定

2.3.1 浸出物測定 參照《中國藥典》2020 年版（四部）通則2201 冷浸法測定浸出物含量[8]：取藥用螞蟻供試品粉末1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，密塞，冷浸，前6 h 振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取續濾液15 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質量。計算供試品中醇溶性浸出物的含量。

2.3.2 總氮量測定 參照游思亮等[9]的方法，利用凱氏定氮儀測定。

2.3.3 蟻酸含量測定 參照鄒耀華等[10]所建立的衍生氣相色譜法。經過方法學驗證，該方法專屬性、精密度、穩定性、加樣回收率均良好。標準曲線方程為Y=6 361.2X–1 065 114（r=0.998 9），表明蟻酸在500～7500 μg?mL–1呈良好的線性關系，該方法適用于螞蟻藥材中蟻酸含量的測定。

2.4 氨基酸類成分的含量測定

參照張曉萍等[11]的方法，利用氨基酸分析儀測得。

2.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 26.0 進行相關數據分析，結果均以（）表示。數據差異顯著性分析借助ANOVA與t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 12批藥用螞蟻樣品中雜質、水分和灰分含量

12 批藥用螞蟻樣品中的雜質、水分和灰分含量見表2。依據《江蘇省中藥材標準》2016年版[12]“螞蟻”項下記載，雜質質量分數應≤5%，總灰分不得過11.0%，酸不溶性灰分不得過6.0%，對水分含量未作規定。結果表明，3、4、6、7、9、12 號樣品雜質符合標準，合格率僅50%。雙齒多刺蟻平均含水量（2.93%）顯著高于葉形多刺蟻（1.96%，P<0.05），其中6 號江西上高縣產雙齒多刺蟻樣品含水量（6.24%）最高。2 種藥用螞蟻灰分含量略有差別，但差異無統計學意義，均符合含量限定值。灰分含量以貴州產區的螞蟻最高。

表2 12批藥用螞蟻樣品中雜質、水分和灰分質量分數（,n=3） %

表2 12批藥用螞蟻樣品中雜質、水分和灰分質量分數（,n=3） %

注：同列不同小寫字母表示P<0.05；表3～表5同。

3.2 12批藥用螞蟻樣品中4種主要微量元素含量

研究發現扶正固本類中藥中Mn、Fe、Cu、Zn元素的含量相對較高[13]。基于螞蟻“合壯藥”的記載，對不同產地2種基原藥用螞蟻中4種微量元素的含量進行測定，結果見表3。葉形多刺蟻中4 種元素平均質量分數分別為263.29、1 048.03、25.69、129.06 mg·kg–1；雙齒多刺蟻中4種元素平均質量分數分別為255.86、643.82、25.77、112.10 mg·kg–1。經t檢驗，葉形多刺蟻中Zn 元素含量顯著高于雙齒多刺蟻（P<0.05），其他3種元素含量種間差異無統計學意義。除Cu 元素外，不同產地藥用螞蟻其余3種元素的差異均具有統計學意義（P<0.05）。廣西產區樣品中Mn、Zn 元素含量高于其他產區，江西產區樣品中Fe元素含量最高。

表3 12批藥用螞蟻樣品中4種微量元素的質量分數（,n=3）

表3 12批藥用螞蟻樣品中4種微量元素的質量分數（,n=3）

3.3 12 批藥用螞蟻樣品中浸出物、總氮和蟻酸含量

葉形多刺蟻浸出物質量分數為17.70%～27.30%，均值為21.74%；雙齒多刺蟻浸出物質量分數為14.16%～33.91%，均值為22.32%。經t檢驗，雙齒多刺蟻浸出物質量分數高于葉形多刺蟻，但差異無統計學意義。就產地差異來看，浸出物質量分數順序為廣東（27.30%）>江西（25.49%）>廣西（22.10%）>貴州（葉形多刺蟻，21.74%）>貴州（雙齒多刺蟻，14.52%）。貴州產區的雙齒多刺蟻含量顯著低于其他產區的雙齒多刺蟻（P<0.05），亦顯著低于貴州產區的葉形多刺蟻（P<0.05）；不同基原與產地的螞蟻藥材樣品浸出物質量分數均能達到15%限定值（表4）。

表4 12批藥用螞蟻樣品中浸出物、總氮和蟻酸質量分數（,n=3）

表4 12批藥用螞蟻樣品中浸出物、總氮和蟻酸質量分數（,n=3）

12 批藥用螞蟻樣品中，葉形多刺蟻總氮質量分數為7.51%～10.12%，均值為8.57%；雙齒多刺蟻總氮質量分數為7.24%～9.74%，均值為8.04%。經t檢驗，葉形多刺蟻總氮質量分數高于雙齒多刺蟻，但差異無統計學意義。就產地差異來看，總氮質量分數順序為廣西（8.70%）>貴州（葉形多刺蟻，8.57%）>廣東（7.95%）>貴州（雙齒多刺蟻，7.73%）>江西（7.46%），廣西產區的雙齒多刺蟻樣品總氮量最高，江西最低（表4）。

蟻酸為藥用螞蟻的特征性成分之一，具有重要的藥理作用。12 批螞蟻樣品中，葉形多刺蟻蟻酸質量分數為9.93～56.49 mg·g–1，均值為36.50 mg·g–1；雙齒多刺蟻蟻酸質量分數為9.68～114.01 mg·g–1，均值為75.97 mg·g–1。雙齒多刺蟻蟻酸質量分數顯著高于葉形多刺蟻（P<0.05）。就產地差異來看，蟻酸質量分數順序為廣東（104.21 mg·g–1）>江西（94.96 mg·g–1）>廣 西（57.81 mg·g–1）>貴 州（雙齒多刺蟻，55.99 mg·g–1）>貴州（葉形多刺蟻，36.50 mg·g–1）。貴州、廣西兩地的雙齒多刺蟻樣品蟻酸含量顯著低于江西、廣東（P<0.05）。

3.4 12批藥用螞蟻樣品中氨基酸類成分含量

12 批藥用螞蟻樣品中水解氨基酸種類豐富，均檢測出17 種氨基酸，包含7 種人體必需氨基酸（EAA）。葉形多刺蟻總氨基酸（TAA）質量分數為37.32%～52.52%，均值為43.20%；總EAA 質量分數為12.74%～18.27%，均值為15.09%。雙齒多刺蟻TAA 質量分數為35.24%～47.05%，均值為38.96%；總EAA 質量分數為12.08%～16.07%，均值為13.46%。葉形多刺蟻氨基酸質量分數高出雙齒多刺蟻約12%，但差異無統計學意義。12 批藥用螞蟻氨基酸含量存在產地差異，TAA 質量分數貴州（41.12%）>廣西（41.06%）>廣東（38.66%）>江西（36.66%），總EAA含量趨勢相同（表5）。

表5 12批藥用螞蟻樣品中水解氨基酸質量分數（,n=3）

表5 12批藥用螞蟻樣品中水解氨基酸質量分數（,n=3）

注：*表示EAA。

4 基于灰色關聯度法的不同產地藥用螞蟻質量比較

4.1 樣品數據集的建立

通過測定12 批藥用螞蟻樣品的5 類主要藥效成分微量元素（Ⅰ）、浸出物（Ⅱ）、總氮（Ⅲ）、蟻酸（Ⅳ）；TAA（Ⅴ）的含量，建立藥用螞蟻質量評價灰色模式識別的數據集，見表6。

表6 12批藥用螞蟻5類主要藥效成分的質量分數

4.2 灰色關聯模型的建立

4.2.1 參考序列的選擇 設有n個研究樣品，每個樣品有m項評價指標，組成評價單元序列{Xik}（i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=12，m=5）。設最優參考序列的各項指標是n個螞蟻樣品對應指標的最大值，記作{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}；最差參考序列的各項指標是n個螞蟻樣品對應指標的最小值，記作{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。

4.2.2 關聯系數與關聯度計算 首先對原始數據進行均值化處理[14]。按照公式（1）、公式（2）分別計算出各評價單元相對最優、最差序列的關聯系數，按照公式（3）、公式（4）分別計算出各評價單元相對最優、最差序列的關聯度，結果見表7、表8。

表7 評價單元相對于最優參考序列的關聯系數與關聯度

表8 評價單元相對于最差參考序列的關聯系數與關聯度

公式（1）與公式（2）中，?min=min|Yik-Ysk|，?max=max|Yik-Ysk|；?'min=min|Yik-Ytk|，?'max=max|Yik-Ytk|；ρ為分辨系數，一般取0.5 即可滿足分辨率要求[15]。

4.2.3 相對關聯度（ri）計算與相關性分析 灰色關聯模型最理想的結果是各評價單元與最優參考序列關聯程度最大而同時與最差參考序列關聯程度最小，由此按照公式（5）計算ri。顯然，ri(s)越大，評價單元序列與最優參考序列的關聯程度越大，評價單元越佳。ri(t)意義相反，其值越小，評價單元越佳。按照公式（5）計算出12 批藥用螞蟻樣品ri依次為0.455、0.379、0.576、0.296、0.367、0.527、0.364、0.467、0.449、0.482、0.380、0.433。

12批藥用螞蟻樣品的ri為0.296～0.576，其中有2 個產地樣品的ri>0.500，有4 個產地樣品的ri為0.400～0.500。綜合分析藥用螞蟻ri發現，3 號貴州凱里市產區的葉形多刺蟻樣品、6 號江西上高縣產區的雙齒多刺蟻樣品、10 號廣西博白縣產區的雙齒多刺蟻樣品的ri分別為0.576、0.527、0.482，居前3 位，表明其藥材質量相對較優。由表9 可知，5 類主要藥效成分中，浸出物含量與ri呈顯著正相關（P<0.01），其他成分與ri相關性不顯著。說明浸出物含量是評價藥用螞蟻藥材質量的主要指標，這一結論與企業生產上評價螞蟻藥材質量過程中首先對浸出物含量及色度進行控制的做法相吻合。

表9 12批藥用螞蟻樣品各成分含量與ri的相關性分析

5 討論

本研究參考《中國藥典》2020 年版通則對12 批藥用螞蟻樣品進行雜質、水分與灰分檢測，發現其含量高低與各地習用的采收時間及加工方式有關。貴州、江西兩地常用燙死法處理螞蟻，廣東、廣西地區則習用悶死法。本研究發現江西產區的螞蟻雜質質量分數最低，僅1.44%，可見江西螞蟻藥材凈度最高。同時，其含水量（3.99%）也最高。據了解，江西地區習慣于當年11 月至次年1 月采挖野生螞蟻巢，將活蟻從巢中抖落后置于熱鐵鍋內燙死，推測含水量高是因為高溫快速致死使螞蟻盡可能地保留了體內水分。秋冬季節采收，避開螞蟻繁殖高峰期，故樣品中螞蟻卵及蛹的占比較小；活蟻從蟻巢震落，能夠有效減少雜質附著，因此江西螞蟻藥材凈度最高。廣東、廣西習慣采挖蟻巢后將蟻巢整個置于塑料袋中，密封1～2 d，悶死螞蟻（窒息死亡使得螞蟻體內水分慢慢流失）后曬干，此時外力將螞蟻從巢中抖落更易黏附雜質。葉形多刺蟻與雙齒多刺蟻相比，蟻體不容易碎裂，藥材完整度較高，但5 號葉形多刺蟻樣品中因含有較多植物種子類雜質導致該樣品雜質量過高，猜測此類果實應當是葉形多刺蟻食物或營巢材料，廣布于其適生環境中。雙齒多刺蟻蟻體極易碎裂，藥材完整度不高，且樣品中往往含有較多藤本類植物的莖葉，砂礫、碎石占比較大。

本研究發現12 批藥用螞蟻蟻酸質量分數為9.68～114.01 mg·g–1，差異幅度較大，2 種藥用螞蟻蟻酸含量種間差異具有統計學意義。就葉形多刺蟻來看，5 號鎮遠縣樣品顯著低于甕安縣與凱里市樣品，推測差異原因有2 點：一是該批葉形多刺蟻肢體表面有較多的雜質、塵土附著物；二是葉形多刺蟻營暫時性社會寄生，通常與弓背蟻屬（Camponotus）螞蟻或綠蠅等其他親蟻物種形成混合群體[16-17]，該批樣品內可能混入了肉眼不易識別的親蟻物種。就雙齒多刺蟻來看，12 號廣西田林縣雙齒多刺蟻樣品蟻酸質量分數不足10 mg·g–1，顯著低于其他產區的雙齒多刺蟻樣品，推測差異源于采收期與加工方式的不同。12 號樣品采收期為每年的3—6 月，市場上稱為“春蟻”，樣品中含有較多帶翅雄蟻與帶翅雌蟻；同樣11 號廣西田林縣雙齒多刺蟻樣品采收期為每年的12 月至次年2 月，市場上稱為“冬蟻”，帶翅雄蟻與帶翅雌蟻數量較少，以無翅工蟻為主。可見采收期不同，對雙齒多刺蟻中蟻酸含量的高低產生了很大影響。12 號樣品與2、4、7 號雙齒多刺蟻樣品相比又存在加工方式的差異。有關不同采收期與加工方式對雙齒多刺蟻蟻酸含量的影響需深入研究。

本研究通過測定不同基原與產地藥用螞蟻的5類主要藥效成分發現，12 批藥用螞蟻樣品不同指標成分含量沒有表現出明顯的規律性，因此如果僅從某單一成分出發很難綜合評價不同基原與產地螞蟻藥材的質量。本研究通過建立灰色關聯度模型對藥用螞蟻質量進行綜合評價，發現雙齒多刺蟻的評價結果與實際應用效果擬合度較高。基于現有研究結果，3 號貴州凱里市產區的葉形多刺蟻樣品具有最高的ri，說明該產區的葉形多刺蟻或具有與雙齒多刺蟻等同的藥用價值，值得進一步探索。這對緩解雙齒多刺蟻野生資源應用壓力具有重要意義。此外，本研究結果顯示雙齒多刺蟻的質量評價結果與企業實際應用情況擬合度較高，說明GRA 在藥用螞蟻質量評價研究方面具備一定的合理性與應用價值[18]，為藥用螞蟻藥材的質量評價提供了參考。