對照提取物在中藥質量控制中的研究現狀及展望△

穆開朗，劉剛，劉育辰，李昌桔，李艷，阮玉蘭

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

近年來，國家高度重視中醫藥事業的發展，多次強調發展中醫藥已經上升為國家戰略、國家意志[1-2]，我國中醫藥事業發展的新格局也逐步形成且備受關注。而中藥材質量參差不齊的問題在一定程度上制約了中醫藥事業的發展[3-4]。科學的中藥質量控制方法是中藥質量均一、穩定的有效保障，也是中醫藥高質量發展和走向國際的基石。

中藥指標性成分的選擇是中藥質量控制研究的關鍵環節。當前，中藥質量控制大多采用化學藥質量控制方法，而中藥是通過多成分協同發揮藥效的[5-6]，以單一指標作為對照評價中藥質量，顯然與中醫藥整體性特點不符，因此，多指標整體中藥質量控制成為具有中醫藥特色的中藥發展必然趨勢。針對此問題，研究者對中藥質量控制方法進行了諸多研究，在中醫藥理論指導下，從單一指標向多指標邁進，先后提出了替代對照品法、一測多評法、中藥指紋圖譜、中藥特征圖譜等多指標中藥質量控制方法[7-11]，為體現中醫藥整體性特點的質量控制方法提供了很好的思路，但在指標成分定性、定量方面仍存在諸多問題[11-13]。

Xie 等[14]于2013 年提出應用對照提取物進行中藥質量控制，對照提取物具有易于制備、專屬性強、穩定性好等優點[15-16]，與中醫藥整體性的特點不謀而合[17-18]，可廣泛應用于中藥多指標定性、定量研究，為多指標中藥質量控制提供了新思路，使中藥質量控制更具有實際意義。但近年來的應用中也發現了很多不足[15,19]。本文就對照提取物的概況、發展及應用現狀進行綜述，在此基礎上對中藥對照提取物發展進行展望，初步提出“有效對照提取物”這一提升概念，以期為中藥質量控制研究科學化提供有益參考。

1 對照提取物的概念及優勢

《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版將對照提取物定義為經特定提取工藝制備的含有多種主要有效成分或指標性成分，用于中藥材（含飲片）、提取物、中成藥等鑒別或含量測定的國家藥品標準物質[20]，豐富了對照提取物的內涵，增強對照提取物應用于中藥質量標準的科學性。此外，對照提取物應符合樣本基原明確（真實性）、不同中藥對照提取物特性明顯（專屬性）、評價同種藥材樣品基本特征或特性相同（一致性）、定性或定量特性隨時間恒定（穩定性）等要求。

針對單味中藥或復方對其中的某一成分或君藥進行測定來控制中藥質量具有一定的片面性[21]，中藥及中藥復方成分復雜，根據中醫藥理論，中藥藥效的發揮是各個組分協同作用的結果[22]。因此，多指標綜合評價對中藥質量標準的建立有重要意義，應用對照提取物進行中藥質量控制具有以下優點：1）對照提取物可以從整體角度反映中藥可檢測化學特征，從而確保中藥產品化學成分批間一致；2）對照提取物中的化學成分可以很容易地替代已知化學參考物質進行定性鑒定，完整的化學特征可以提供更詳細的質量評估；3）藥物有毒化合物制備成對照提取物，可大大減小其毒性，降低安全性風險，如烏頭堿類有毒成分制成單酯型/雙酯型烏頭堿對照提取物；4）對照提取物色譜峰的積分值可作為簡單的半定量分析，供藥材指標成分的定量參考；5）對照提取物作為質量控制參考物質成本較低。目前，國內外有關中藥對照提取物研制的品種和數量均較少，中藥質量控制大多借鑒化學藥控制模式，但由于中藥成分復雜，中藥對照品制備技術要求高、成本高，難以大量生產。此外，部分中藥對照品不穩定，給使用、儲存和運輸造成困難。同時，多種化學對照品的使用使中藥質量控制成本大幅提高，現實可行性不強[23]。相較于化學藥單一對照品和基于中醫藥整體性特點的對照藥材，對照提取物都具有獨特的優勢，在對相關文獻進行總結分析后[15-16,23-25]，總結出對照提取物、化學對照品、對照藥材各自特點（表1），在制備難易、成本、質量控制指標、批間重復性、定量準確性、應用難易方面對照提取物均有一定的優勢，表明了其應用于中藥質量控制具有較好的前景。

表1 化學對照品、對照藥材、對照提取物特點

2 對照提取物在中藥質量控制中的研究現狀

2.1 《中國藥典》中收載對照提取物情況

《中國藥典》2005 年版首次收載11 種對照提取物，之后各版《中國藥典》逐漸增加對照提取物的收載數量，到《中國藥典》2020 年版共收載28 種對照提取物，表明對照提取物作為標準物質有較大的發展潛力[20,26]。

《中國藥典》2020年版（一部）收載中藥2711種，分為藥材和飲片、植物油脂和提取物、成方制劑和單味制劑3 部分內容。目前已將部分對照提取物應用于中藥的各項檢測項目中（表2）。其中成方制劑和單味制劑應用對照提取物進行質量控制的品種最多，包括棗仁安神膠囊、棗仁安神顆粒、康萊特軟膠囊、云南白藥、云南白藥膠囊、前列通片、血塞通片、血塞通膠囊、血塞通顆粒、血栓通膠囊、注射用血塞通、注射用血栓通、血塞通注射液、血栓通注射液、血塞通軟膠囊、加味藿香正氣軟膠囊、香連片、烏靈膠囊、金水寶片、金水寶膠囊、地奧心血康膠囊、銀杏葉片、銀杏葉膠囊、銀杏葉滴丸、銀杏葉口服液、銀杏葉軟膠囊、養正消積膠囊、寬胸氣霧劑、八味檀香散、宮血寧膠囊30 種；植物油脂和提取物應用對照提取物進行質量控制的品種包括人參莖葉總皂苷、八角茴香油、松節油、三七總皂苷、銀杏葉提取物、薄荷素油等；藥材和飲片應用對照提取物進行質量控制的品種包括陳皮、功勞木、薏苡仁、檀香、羌活、川烏、馬錢子7種。對照提取物在《中國藥典》2020年版質量控制項下以鑒別項應用最多，含量測定、檢查、特征圖譜等質量控制項應用較少（表3），表明對照提取物作為標準參照物進行中藥多指標質量控制還有較大的開發潛力，對照提取物在中藥質量控制中的應用仍需進一步完善與提升。

表2 《中國藥典》收載的28種對照提取物應用情況

2.2 在國外的應用概況

國外藥典中對照提取物（或對照制劑）被定義為二級參考物質，必須有相應的一級標準定期或定時對其進行校準。在國外藥典中天然產物質量控制項下已被廣泛應用[27-29]。自2004以來，歐洲藥品質量管理局在天然產物標準物質研究方面做了大量工作。目前，《歐洲藥典》第11版已使用對照提取物對多種天然藥物進行定性鑒別，如圣約翰草對照提取物用于測定金絲桃素、偽金絲桃素總含量；越橘對照提取物用于測定總花青素含量；奶薊草（又名水飛薊）對照提取物用于測定水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B、次水飛薊素、水飛薊寧的總含量，以及水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧的含量[27]。

《美國藥典》第44版[28]中對照提取物大多應用于薄層色譜法（TLC）鑒別測試及系統適用性試驗或某些峰的識別等，其中對照提取物不僅作為藥材色譜峰定位的標準物質，也應用于藥材提取物、揮發油、流浸膏等色譜峰的定位，對照提取物用于色譜峰定位在《歐洲藥典》第11版、《美國藥典》第44版中使用廣泛。《日本藥局方》第18版[29]天然藥物鑒別主要采用理化鑒別，近1/3 的天然藥物無含量測定項。有薄層鑒別項的也僅選取1種或2種單一化學成分作為指標，含量測定項也相對簡單，基本控制某些單一成分，質量體系較為單一，缺乏整體控制指標，無定量對照提取物應用。由此可見，對照提取物作為一種標準參照物仍具有較大的開發利用潛力。

2.3 在中藥材及飲片質量控制中的研究現狀

中藥材是中藥飲片的原料，是中成藥（復方制劑）的源頭。中藥材在中醫藥理論指導下，經過加工炮制后可直接用于調配或制劑的加工炮制品稱為中藥飲片，中藥材質量的優劣可一定程度上影響其加工炮制得到的中藥飲片質量[30]，中藥飲片的質量直接關乎中醫臨床療效。中藥材及飲片成分多樣且復雜，以單一化學對照品控制其質量，所提供的信息遠達不到整體質量控制的目的，以對照提取物控制中藥材及飲片質量可完善中藥質量標準，解決部分中藥標準缺失和炮制前后成分改變而標準未變等問題。

Xie等[14]提出應用對照提取物進行中藥質量控制之初，即對酸棗仁、浙貝母2 種中藥應用薄層鑒別、高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜分析，說明了對照提取物應用于中藥質量控制的可行性。此后，國內外研究者采用此方法對多種中藥材質量進行了更深入的研究。楊麗麗等[31]采用溶劑提取法、色譜分離法制備了枳實黃酮對照提取物，以枳實中的代表性的成分蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4 個成分為對照，對枳實黃酮對照提取物含量進行標定，隨后分別以已知含量的枳實黃酮對照提取物和4個單體成分為對照，建立了枳實藥材HPLC含量測定方法，并對其中4 個成分含量進行測定。結果采用t檢驗和相關性統計分析，結果表明2 種方法無明顯差異。Wang 等[32]采用單一參考標準確定多化合物、對照提取物定量分析等方法，開發了十大功勞藥材中非洲防己堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿4 個生物堿的含量測定方法。將這些方法與外標法進行了綜合比較，結果表明采用對照提取物法可以準確地完成定量。Jing 等[33]采用硅膠柱色譜、反相制備色譜法以隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA為指標制備丹參對照提取物，并利用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）對其質量進行評估。朱星宇等[34]自制了補骨脂對照提取物并采用HPLC 標定了其中補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂甲素、補骨脂定、補骨脂乙素、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂酚7 個成分的含量，并對12批補骨脂飲片7個成分含量進行測定，然后與對照品測定法的結果進行比較，結果表明2種測定方法所得數據的RSD<3%，差異無統計學意義。此外，相關文獻也分別利用此方法對女貞子飲片和五味子飲片質量控制進行了研究，均說明對照提取物應用于中藥質量控制具有可行性[35-36]。

2.4 在中成藥質量控制中的研究現狀

中成藥是現代醫藥的重要組成部分，在臨床防治疾病中起到關鍵作用[37-38]。中成藥組成藥味多、成分復雜，鑒別和質量控制困難較大，僅用某一味味藥或單一成分難以體現整個制劑的藥效，也不符合中醫藥整體性觀念。因此，應用對照提取物進行中成藥質量控制研究已迫在眉睫。針對此問題，國內外研究者利用對照提取物法對中成藥質量控制進行了更加深入的研究，在查閱相關文獻后，對近10 年利用對照提取物進行中成藥質量控制情況進行了總結分析（表4）。由表4 可知，對照提取物在中成藥質量控制中已有較多研究，但研究內容大多為含量測定方面，未能將對照提取物在中成藥成分定性、定量中的優勢完全展現，對照提取物在中成藥質量控制中的應用還需更加深入的研究。

表4 近10年對照提取物在中成藥質量控制中的研究現狀

3 展望

3.1 加強對照提取物的研制，積極進行對照提取物的應用探索

目前，國內外采用對照提取物進行質量控制的藥物品種數量較少，為降低中藥質量控制成本，擺脫化學對照品價格高昂、種類有限的束縛，加強中藥整體質量控制水平，推進中藥國際化，應大力開展同時標識多個指標成分的中藥對照提取物的制備研究，完善中藥整體質量控制評價體系。對照提取物雖然在成分定性、定量上表現出明顯的優勢，但目前對照提取物的應用也多限于“一標多測”的指標性成分含量測定及部分中藥的薄層鑒別中，未能完全體現對照提取物的優勢。因此，在進行對照提取物研制的同時，要積極開展其應用探索，在對照提取物對中藥質量控制定性、定量的應用基礎上，嘗試其由標準參照物向中藥固體/半固體制劑原輔料、注射劑原輔料、禽畜業抗病飼料輔料等領域的應用探索。

3.2 強化對照提取物與作用功效的關聯性，深入開展“有效對照提取物”研究

中藥質量控制最根本的目的是保障臨床用藥的安全性、有效性及穩定性，因此，在保證用藥安全、穩定最基本要求的基礎上，與藥效關聯的“有效”即成為了中藥質量控制研究的關鍵。目前，對照提取物研究重點多為替代多個單一指標成分的含量測定，而對中藥對照提取物的有效性未做深入研究，且多指標成分是否可代表中藥藥效物質基礎也有待商榷。多指標成分整體功效的有無，各指標成分間的協同/拮抗作用，都是值得更進一步研究。因此，對照提取物研制過程中應增加對其有效性的探究驗證，推進中藥質量控制研究從藥物-藥效基礎-指標成分的重點控制模式，到藥物-藥效物質群-有效對照提取物的整體質量控制思路轉變，中藥“有效對照提取物”研究流程見圖1。借助現代化學物質組學-代謝組學、譜-效關系學、生物學效應、網絡藥理學等多學科、多領域交融，大力開展“有效對照提取物”研究，加強中藥標準參照指標的代表性，促進對照提取物向臨床應用的轉變，加快中藥質量控制體系的完善進程，使對照提取物成為中藥質量標準的參照物、臨床防治疾病的有效品。

圖1 中藥“有效對照提取物”研究流程

3.2.1 “有效對照提取物”的研制方法 中藥對照提取物是中藥質量的參照物質，在其研制過程中需遵循藥材基原準確、提取工藝合理、指標成分選擇科學、定量定性穩定等基本要求。

3.2.1.1 藥材樣品來源 在對照提取物的研制過程中，藥材樣品應具有充分的代表性，參照《中國藥典》2020 年版藥材及飲片研究的相關要求[20]，一般選取至少3 批符合《中藥材生產質量管理規范》（GAP）要求栽培的優質道地藥材進行對照提取物研制，對收集樣品進行真偽、道地等鑒別，可采用傳統性狀與中藥材DNA 條形碼分子鑒別等方法，以保障樣品基原的準確性，從而確保對照提取物研制的可靠性。

3.2.1.2 指標性成分的選擇 中藥質量控制的指標性成分選擇是中藥質量控制的核心環節，應以效應成分的辨識與確認為基礎，凸顯傳統道地性，符合生產規范性，體現安全有效性，保證穩定可控性，強化鑒別專屬性，彰顯內在關聯性、綜合性[55]，在此基礎上，選擇化學結構母核或極性相似的一類成分，如總皂苷、總生物堿等作為中藥對照提取物的指標性成分。

3.2.1.3 提取工藝 對照提取物提取過程可按照天然藥物有效成分提取方法[19]。一般可采用傳統的溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、升華法、透析法等，也可采用新興的超臨界流體萃取、微波提取、超聲波提取、酶法提取、半仿生提取、破碎提取、空氣爆破、亞臨界流體萃取等方法。提取液經濃縮后，含多糖、蛋白質、鞣質等雜質較多的，需要進一步純化，可將濃縮液通過萃取、醇沉、酸堿沉淀等方法初步除雜，再經硅膠、離子交換樹脂、大孔吸附樹脂、凝膠等柱色譜方法進一步純化，必要時還可以采用中壓或高壓液相色譜進行制備。

3.2.1.4 有效性驗證 有效性驗證是“有效對照提取物”區別于對照提取物的重要一點，也是對照提取物由標準參照物走向制劑原料的必要環節[4,56]。應根據具體原藥材、飲片或成方制劑的特點，進行有針對性的研究，同時，注重考察對照提取物與原料樣品之間的聯系，對結果與評價指標進行科學分析，采用現代體內外藥理、血清藥理、代謝組學、譜-效關系等驗證，如中藥復方藥效學研究與藥動學結合的濃度-效應-時間研究、蛋白組學與基因芯片結合的分子-細胞-器官-整體研究等對對照提取物進行有效性驗證。

3.1.2.5 定性、定量方法 對照提取物在制備后需進行定量賦值與定性鑒別等研究。一般采用紫外-可見分光光度法、HPLC、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）、GC-MS 等用于對照提取物的定量研究，通過考察多個單一對照品法測定多批樣品的含量測定結果與對照提取物含量測定結果的差異性，探討對照提取物代替多個單一對照品的可行性并進行賦值[9,52,56]。為了對中藥材或其成方制劑進行鑒別，需要對對照提取物進行定性鑒別研究。與定量賦值研究類似，可采用標準TLC、標準指紋圖譜等進行定性鑒別，通過與多個單一對照品的比較研究，確定可用于藥材或成方制劑的標準TLC 及標準指紋圖譜鑒別方法。

3.2.2 研究舉例

3.2.2.1 苗藥黑骨藤有效對照提取物的研制 黑骨藤系蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨Periploca forrestiiSchltr.的干燥根或全株，現代研究表明，黑骨藤乙醇提取物的乙酸乙酯部位為其抗類風濕性關節炎（RA）的有效部位。

本課題組對21 批基原明確的苗藥黑骨藤采用溶劑（乙醇）提取法，減壓濃縮后采用系統溶劑萃取法獲得乙酸乙酯部位，利用HPLC 對21 批黑骨藤樣品進行含量測定并利用化學模式識別得到苗藥黑骨藤抗RA 有效部位中6個咖啡酰基奎寧酸類主要差異成分[58]。采用柱色譜法富集黑骨藤抗RA 有效部位中的6 個咖啡酰基奎寧酸類成分，制備其對照提取物，進一步構建膠原誘導類風濕性關節炎（CIA）大鼠模型，測定大鼠足趾厚度、關節炎指數及大鼠血清促炎細胞因子[白細胞介素（IL）-6、IL-1β、和腫瘤壞死因子（TNF）-α]，觀察踝關節滑膜組織病理變化，驗證黑骨藤抗RA 對照提取物的有效性，結果顯示黑骨藤抗RA對照提取物活性顯著，可減少CIA大鼠足趾腫脹、降低關節炎評分、改善滑膜組織病理學變化。最后成功利用黑骨藤有效對照提取物，采用超高效液相色譜法（UPLC）建立測定苗藥黑骨藤有效對照提取物（包括6 個咖啡酰基奎寧酸類成分）含量的方法，并建立了其抗RA 功效的質量評價體系。

3.2.2.2 白及藥材有效對照提取物的研制 白及為蘭科植物白及B1etilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥塊莖，《中國藥典》2020 年版首次收載了白及的定量分析方法，以單一指標白及苷作為質量控制指標顯然不符合中藥多組分整體質量控制觀，而白及中許多成分的標準對照品存在制備困難、有價無市的情況。因此，采用“有效對照提取物”模式進行白及藥材質量控制至關重要。

本課題組利用UPLC-飛行時間質譜法（UPLCQ-TOF/MS）、中藥指紋圖譜結合化學模式識別等方法，對50 批基原明確的白及藥材樣品進行成分鑒定與差異性成分分析，確定了白及藥材中一類特異性成分2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類化合物可作為白及藥材質量控制指標[59]。采用溶劑提取法經減壓濃縮后得到白及藥材提取浸膏，利用大孔樹脂色譜分離純化、富集白及對照提取物。進一步構建大鼠出血模型，測定大鼠出血時間、凝血時間、血小板聚集率、凝血因子（血漿凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、組織纖維溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制劑-1）等指標。結果顯示，白及對照提取物具有良好的止血效果，甚至在某些指標上顯著優于陽性對照藥品（云南白藥）。最后成功利用白及有效對照提取物，采用UPLC 建立了測定中藥白及對照提取物（包括4個2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類化合物）含量的方法，并建立了簡便易行的中藥白及質量評價體系。基于上述研究，本課題組撰寫了白及飲片質量標準增訂草案及起草說明。

4 結語

近年來，中醫藥發展得到國家政策的大力支持，同時，隨著經濟社會發展和生活水平的提高，人民群眾健康需求也不斷增長，中醫藥發展迎來了一個嶄新的春天[60]。中醫藥現代化進程也明顯加快，但由于中藥成分復雜，藥理作用依賴多組分、多靶點、多途徑實現，中藥質量控制就成為了中藥產業發展亟待解決的關鍵問題之一。對中藥質量控制方法逐步完善，由初級向更深層次邁進，現代技術手段與方法也已經取得了許多成果，從單一特征指標性成分逐步向有效多指標成分綜合評價過渡[61]。

對照提取物的應用從整體性角度完善了中藥質量評價體系，但目前國內外對照提取物品種和數量較少，化學對照品在藥品質量控制領域仍占據主導地位，國內外均尚未建立完整的對照提取物評價標準及相關數據庫，對照提取物在醫藥領域作為一種標準參照物有著其獨特的優勢，但標準建立困難，穩定性、均一性難以控制等也是中藥質量控制的重大挑戰。基于對照提取物的中藥“有效對照提取物”提升概念，為中藥質量控制提出了新要求，同時也為中藥整體質量評價帶來了新的思路。以類群成分專屬性為基礎，強化中藥質量控制指標與其功效的關聯性，促進中藥質量控制體系逐步完善，有利于健全中藥整體質量控制體系，從而推動實現中藥產業現代化與國際化。