基于LC-MS/MS技術同時定量分析片仔癀中特征胰酶水解肽△

李文正，劉文靜，曹妍，李瑋，趙晨，劉叢盛*，宋青青*，宋月林

1.北京中醫藥大學 中藥學院 中藥現代研究中心，北京 100248；

2.漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建 漳州 363000

片仔癀是國家一級中藥保護品種，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效[1]。現代藥理學研究表明，片仔癀具有抗炎、抗腫瘤、保肝等多種作用[2-5]，臨床應用廣泛。目前已公開的藥味包括植物藥三七，以及天然麝香、蛇膽和牛黃3 味名貴動物藥[4]，其中三七皂苷、麝香酮、膽汁酸等小分子化合物已被深入研究，并作為片仔癀質量標志物用于其質量評價[6-10]。蛋白、多肽等大分子化合物雖也表現出廣泛的藥理活性，如麝香多肽具有抗炎、抗癌的作用[11-12]，三七中含有抗真菌蛋白[13]，但未對其進行深入分析和研究。

鳥槍法蛋白組學通過酶解樣品中的蛋白，采用液相色譜-質譜法（LC-MS）對肽段進行分離鑒定，從而實現蛋白的全譜分析。該策略能夠實現復雜樣品中蛋白高通量的定性、定量分析[14]，尤其適用于富含大量蛋白的動物類中藥的分析。但基于該平臺的多肽定量分析靈敏度較差、動態線性范圍窄，難以滿足樣品中種類多且含量差異大的蛋白的全面精準定量分析。三重四極桿（QqQ）-MS 的選擇反應監測（SRM）被視為絕對定量的金標準[15]，前后2 個四極桿（Q1、Q3）作為質量過濾器，中間四級桿（Q2）作為碰撞池發生碰撞誘導解離產生碎片離子，設定前體離子和碎片離子分別通過Q1和Q3可以增強選擇性，提高靈敏度，定量線性范圍更是增加到5 個數量級[15]。然而，SRM 建立的關鍵在于獲得被測物的最佳質譜參數。Skyline 軟件能夠預測SRM 參數[16]，但受不同分析儀器的限制，其推薦的SRM 參數并不能使所有QqQ-MS 發揮定量優勢。本課題組前期建立了在線能量分辨（online ER）-MS，可以在各種QqQ-MS 平臺實現不依賴于對照品的質譜參數優化[17-18]，提高了方法的靈敏度，擴寬了線性范圍。

本研究基于鳥槍法蛋白組學策略，利用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 結合UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）分析并鑒定片仔癀中蛋白類成分，篩選特征肽，采用online ER-MS 優化質譜參數，建立反相液相色譜（RPLC）-SRM 定量分析方法，測定了11 批片仔癀中的3 個胰酶水解特征肽含量，可為片仔癀的質量標準提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ME204 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；5424R 型離心機（德國艾本德公司）；MQD-S2P 型恒溫雙層搖床（上海旻泉儀器有限公司）；UltiMate 3000 型納升級超高效液相色譜系統、Q Exactive HF 型質譜儀（美國賽默飛公司）；LC-20ADXR 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Qtrap 5500 型質譜儀（美國Sciex 公司）；10 kDa 超濾管（美國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

二辛可寧酸（BCA）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；三氯乙基磷酸酯（TCEP，北京博奧拓達科技有限公司）；碘代乙酰胺（美國Sigma 公司）；比伐盧定（上海源葉生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美國普洛麥格公司）；碳酸氫銨和尿素（北京化工廠）；質譜級甲酸和乙腈（美國賽默飛公司）；超純水由實驗室Milli-Q 型純水系統制備；多肽ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 由上海源葉生物科技有限公司合成（純度≥98%）。

各批片仔癀由漳州片仔癀藥業股份有限公司提供（表1），樣品存放于北京中醫藥大學中藥學院中藥現代研究中心。

表1 11批片仔癀樣品信息及其總蛋白質量分數 %

1.3 混合對照品溶液制備

分別取多肽對照品ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 適量，精密稱定，用純水溶解，配制成質量濃度為1 mg·mL–1的儲備液。精密吸取各對照品儲備液，用純水制備成終質量濃度均為10 μg·mL–1的混合對照品溶液，用純水逐級稀釋，得到系列質量濃度的對照品溶液，待用。

取比伐盧定適量，精密稱定，用純水配成質量濃度為1 mg·mL–1的內標（IS）儲備液，稀釋至質量濃度為100 μg·mL–1，待用。

精密吸取各對照品溶液50 μL，分別加入等體積的內標溶液，得到系列質量濃度的含內標的混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱定各批片仔癀50 mg，分別加入甲醇1 mL，超聲提取30 min，在4 °C、7607×g離心10 min，去上清液；加入50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液1 mL，超聲提取30 min，7607×g離心，取上清液，重復操作，合并上清液至4 mL 離心管，冷凍干燥16 h，加入純水200 μL 復溶，得到片仔癀總蛋白溶液，BCA法測定總蛋白濃度。隨后，采用過濾輔助提取法制備片仔癀多肽樣品。取一定體積的片仔癀總蛋白溶液（蛋白質量為2.5 mg），在95 °C 加熱5 min，放至室溫，加入TCEP，尿素補足至300 μL使TCEP終濃度為10 mmol·L–1，在67 °C 加熱10 min，然后放至室溫。將樣品轉移至10 kDa超濾管，15 871×g離心30 min后加入100 mmol·L–1碘乙酰胺溶液100 μL，避光反應30 min，加入8 mmol·L–1尿素100 μL，15 871×g離心30 min；加入50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液200 μL，15 871×g離心30 min，重復2次，棄去超濾液；在超濾管中加入胰蛋白酶（胰酶∶蛋白為1∶50），于37 °C、200 r·min–1的搖床中酶解16 h，更換離心管，離心收集超濾液，加入水100 μL，再次離心，收集超濾液，合并2 次超濾液，冷凍干燥，加入純水100 μL復溶，得到片仔癀酶解多肽樣品。吸取上述酶解樣品50 μL，加入等體積內標溶液，即得供試品溶液。

1.5 Nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS分析

采用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap MS 系統，分析片仔癀酶解多肽樣品。EASY-SprayTM色譜柱（100 mm×0.75 mm，3 μm，美國賽默飛公司）；進樣量為2 μL；流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～5.0 min，5%～8%B；5.0～68.0 min，8%～35%B；68.0～75.0 min，35%～50%B；75.0～80.0 min，50%～100%B；80.0～85.0 min，100%B；85.0～85.1 min，100%～5%B；85.1～90.0 min，5%B）；柱溫為60 °C；流速為0.5 μL·min–1。質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，標準化碰撞能（CE）為35%，活化時間為10 ms，MS1全掃描范圍m/z350～1500，分辨率為60 000；MS2譜圖以FTMS模式采集，掃描范圍m/z120～1970，分辨率為7500。

將質譜數據導入MaxQuant 1.6.10，使用Andromeda 肽段搜索引擎及UniProt 數據庫檢索，參數設置如下：蛋白和多肽假陽性率（FDR）≤1%；酶解方式為胰蛋白酶酶切（Trypsin）/P；酶切遺漏數為2；固定修飾為半胱氨酸烷基化；可變修飾為甲硫氨酸的氧化和蛋白N端乙酰化。

1.6 基于RPLC-SRM的片仔癀特征肽定量分析

采用LC-Qtrap MS/MS系統對片仔癀酶解多肽樣品中3 個特征肽進行定量分析。色譜柱為HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters 公司）；柱溫為40 °C；流速為0.2 mL·min–1；進樣量為5 μL；流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗 脫（0～2.00 min，12%～15%B；2.00～3.00 min，15%～30%B；3.00～6.00 min，30%～35%B；6.00～7.00 min，35%～55%B；7.01～12.00 min，12%B）。質譜檢測采用ESI正離子模式，離子源參數：氣簾氣（CUR）為35 psi（1 psi≈6.895 kPa），碰撞氣（CAD）為High，噴霧電壓為5500 V，溫度（TEM）為450 °C，離子源氣體1（GS1）為55 psi，GS2為55 psi。

采用online ER-MS 對3 個特征肽離子對的質譜參數進行優化，首先將高分辨質譜采集得到的前體離子與MS2中響應高的子離子配對，進而派生出一系列擬離子對（PITs），給予PITs 階梯式CE，通過擬合裂解曲線獲得最佳碰撞能（OCE）。以VAPLGEEFR 為例，其前體離子[M+2H]2+m/z為509.29，MS2中主要碎片離子m/z為847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、424.22（y72+），構建4對候選離子對m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，進而衍生出4 組PITs，如m/z509.3→847.4 可以衍生出1 組PITs 509.290→847.401、509.290→847.402、509.290→847.403等，以2 eV為步長，每個PIT掃描時間為5 ms，采集CE 為6～50 eV 的峰面積。峰面積經歸一化處理后，導入GraphPad Prism 8.0軟件進行高斯曲線擬合，獲得各離子對裂解曲線，曲線頂點對應的CE 即為OCE。VAPLGEEFR 的其余離子對m/z509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 的離子對及相應CE 均按上述方法優化。

1.7 方法學驗證

1.7.1 線性和靈敏度 分析1.3 項下各質量濃度混合對照品溶液，以被測成分峰面積/內標峰面積作為縱坐標（Y），以質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到標準曲線與線性范圍。以信噪比（S/N）約為3的被測成分質量濃度作為檢測下限（LLOD），以S/N 約為10 的被測成分質量濃度作為定量下限（LLOQ）。

1.7.2 精密度考察 在被測成分的線性范圍內，取高（500 ng·mL–1）、中（125 ng·mL–1）、低（31 ng·mL–1）質量濃度進行日內精密度考察，每個質量濃度連續進樣6次，記錄峰面積。

1.7.3 重復性考察 按1.4 項下方法平行制備5 份供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積。

1.7.4 穩定性考察 取同一份供試品溶液，在4 °C保存，分別在0、2、4、8、12 h 分別進樣測定，記錄峰面積。

1.8 特征肽的含量測定

按1.4 項下方法制備11 批片仔癀供試品溶液，按1.6 項下方法建立的定量方法進樣分析，將峰面積比值（分析物峰面積/內標峰面積）代入標準曲線，求得待測物質量濃度，計算各批片仔癀中目標多肽含量。

2 結果與討論

2.1 總蛋白樣品制備條件的優化

為提高片仔癀樣品總蛋白的提取率，本研究分別考察了不同提取溶液（RIPA 裂解液、水、50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液、甲醇和50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液）、料液比（1∶10、1∶20、1∶50）、提取時間（0.5、1.0、2.0 h）對提取效率的影響，通過BCA 法測定總蛋白含量。結果表明，采用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液提取蛋白效率顯著高于RIPA 裂解液和水，同時，采用甲醇提取片仔癀樣品，棄去上清液后用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液提取，與單獨使用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液的蛋白提取效率近乎一致，且進一步減少了基質中脂溶性雜質的干擾；料液比1∶20與1∶50提取得到的總蛋白含量差異無統計學意義，但均高于料液比1∶10時提取總蛋白含量；不同提取時間得到的總蛋白量差異無統計學意義。最終，片仔癀樣品提取條件為采用料液比1∶20，先甲醇提取0.5 h 并去除上清液，沉淀用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液再次提取0.5 h。BCA法測得各批片仔癀總蛋白質量分數見表1。

2.2 片仔癀中蛋白多肽的定性分析

高分辨nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 采集的片仔癀酶解多肽樣品的總離子流圖見圖1。使用MaxQuant 1.6.10 軟件對采集到的質譜數據進行處理，利用Andromeda 與UniProt 數據庫鑒別多肽序列，并歸屬蛋白來源。最終，從片仔癀胰酶水解多肽樣品中鑒定了343個肽段，來源于200個蛋白，以酶和骨架蛋白為主。各蛋白的氨基酸數目為18～4563，匹配肽段數為1～13，序列覆蓋率為0.33%～100.00%，鑒定得分前20 的蛋白見表2，其中16 個蛋白來源于牛，1個蛋白來源于人參。

圖1 片仔癀酶解多肽樣品的nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS總離子流圖

表2 片仔癀中鑒別得分前20的蛋白

在此基礎上，選擇無修飾、無漏切位點、響應高、穩定性好且長度適宜的特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 和VAPLGEEFR 進行定量分析。ALSSALHER 來源于酶（alpha-amylase A type-1/2，P0C1B3）、TLLEGEESR 來源于骨架蛋白（keratin,type Ⅱ cytoskeletal 1，P04264）、VAPLGEEFR 來源于載脂蛋白（apolipoprotein A-I，P15497）。

2.3 RPLC-SRM定量方法的建立

2.3.1 RPLC-SRM 方法的優化 為了實現RPLCSRM 對3 個特征肽定量測定，除了在色譜上對待測物的有效分離，避免其流出而造成的離子化競爭，更需要設置適宜的待測物質譜參數，提高其質譜響應。雖然多肽質譜參數可以通過Skyline 軟件預測得到，或是通過注射對照品手動優化獲得，但不可避免會有檢測靈敏度低、多肽對照品消耗量大、優化過程費時等缺點。Online ER-MS 策略無需對照品便能實現質譜參數的精確優化，獲得優于Skyline 預測的質譜參數。

以VAPLGEEFR 為例闡明CE 優化過程。首先，通過高分辨質譜采集到多肽VAPLGEEFR 的MS1前體離子信息[M+2H]2+m/z為509.29，MS2主要碎片離子為酰胺鍵斷裂生成的m/z918.47（y8+）、847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、580.28（y4+）、451.23（y3+）、424.22（y72+）、322.19（y2+）、268.17（b3+）、175.12（y1+）（表3，圖2），選擇其中響應較高的碎片離子m/z為847.43、750.38、637.30、424.22，構建4 對候選離子對m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，進而衍生出4 組PITs（m/z509.290→847.431、509.290→847.432、509.290→847.433等，m/z509.290→750.381、509.290→750.382、509.290→750.383 等，m/z509.290→637.301、509.290→637.302、509.290→637.303 等，m/z509.290→424.221、509.290→424.222、509.290→424.223 等）。以2 eV 為步長，在CE 為6～50 eV 時，賦予每個PIT 1個CE，每個PIT掃描時間5 ms。由于Qtrap的Q1和Q3分辨率低，無法識別PITs之間50 mDa以下的差異，因此能夠采集得到同一化合物不同CE下對應的峰面積，也能通過Analyst軟件SRM模式進行自檢。將多肽VAPLGEEFR 4組PITs在不同能量下的峰面積進行歸一化后導入GraphPad Prism 8.0 軟件，分別采用高斯曲線擬合裂解曲線，m/z509.3→847.4 的高斯曲線方程為Y=13.2×exp{–0.5[(X–23.3)/7.8]2}，OCE 為23.3 eV；m/z509.3→750.4的高斯曲線方程為Y=14.2×exp{–0.5[(X–28.9)/7.6]2}，OCE為28.9 eV；m/z509.3→637.3的高斯曲線方程為Y=30.5×exp{–0.5[(X–28.6)/7.4]2}，OCE為28.6 eV；m/z509.3→424.2 的高斯曲線方程為Y=100.9×exp{–0.5[(X–20.6)/5.0]2}，OCE為20.6 eV（圖3）。與Skyline 軟件推薦的結果相比，多肽VAPLGEEFR 4個候選離子對相同，且各離子對的CE預測值均為24.8 eV，不能達到各離子對的最佳響應，如離子對m/z509.3→424.2在24.8 eV 時的響應僅為在OCE（20.6 eV）時的70%，故online ER-MS能夠獲得最佳質譜參數用于建立多肽定量方法。雖然多肽VAPLGEEFR 4 個候選離子對中m/z509.3→424.2響應最高，但該離子對專屬性差，同時能檢測到另一色譜峰且與VAPLGEEFR 分離度差，因此為了保障分析方法的專屬性、靈敏度，最終選擇m/z509.3→637.3（28.6 eV）作為定量離子對。

圖2 片仔癀胰酶酶解樣品中特征肽VAPLGEEFR的MS2譜圖及結構注釋

圖3 多肽VAPLGEEFR候選離子對的裂解曲線

表3 片仔癀3個特征肽多級質譜及其定量離子對、CE信息

另2 個特征肽ALSSALHER 與TLLEGEESR 同樣采用online ER-MS 策略進行分析，最終多肽ALSSALHER 的定量離子對為m/z492.3→799.4，高斯曲線Y=100.0×exp{–0.5[(X–25.0)/6.6]2}，OCE為25.0 eV，多肽TLLEGEESR的定量離子對為m/z517.3→819.4，高斯曲線Y=104.2×exp{–0.5[(X–24.4)/7.6]2}，OCE為24.4 eV（表3）。

將已優化好的3個多肽質譜參數輸入SRM列表，初步建立SRM 方法，進一步通過優化流動相和洗脫程序來完善分析方法。與其他甲醇-水等流動相體系相比，選用乙腈-甲酸水體系時，各多肽離子對的響應提高，且色譜峰形良好。通過優化色譜洗脫條件，最終各分析物及內標的出峰時間為1.89～8.03 min，能夠實現快速分離和分析（圖4）。

圖4 片仔癀3個特征肽及內標的提取離子流圖

2.3.2 方法學驗證 方法學驗證結果見表4。3 個特征肽LLOD 與LLOQ 分別為3.9、7.8 ng·mL–1，線性范圍為7.8～10 000.0 ng·mL–1，日內精密度RSD≤13.45%，重復性RSD 8.46%～27.51%，穩定性RSD≤35.41%，方法靈敏度高，線性關系、精密度與重復性良好，符合多肽的定量要求。

表4 片仔癀3個特征肽的RPLC-SRM定量方法學驗證結果

2.4 各批片仔癀定量結果

11 批片仔癀目標多肽含量的測定見表5。結果顯示，3 個特征肽在11 批片仔癀樣品中均被檢出，ALSSALHER 質量分數為 0.06～0.44 μg·g–1，TLLEGEESR 質量分數為 0.08～0.26 μg·g–1，VAPLGEEFR 質量分數較高，為0.27～1.09 μg·g–1。除PTH9之外，3個特征肽在其余10批片仔癀中的質量分數均為VAPLGEEFR>ALSSALHER>TLLEGEESR，不同批間均一性較好。

表5 RPLC-SRM定量分析11批片仔癀中目標多肽的質量分數

3 結論

本研究采用LC-MS 實現了片仔癀中蛋白的鑒定及特征肽的定量分析。基于鳥槍法蛋白組學策略，采 用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS，結 合UniProt 數據庫，共從片仔癀中鑒別了來源于200 個蛋白的343 個肽段，從中篩選3 個特征肽（ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR）作為其質量標志物進行分析。基于不依賴于對照品的online ER-MS 策略，獲得了3 個目標多肽的定量離子對及OCE，其優化結果顯著優于Skyline軟件預測的質譜參數，且與利用對照品手動優化相比，節省了多肽對照品及分析時間。建立的RPLC-SRM 分析方法方法學驗證結果良好，11 批片仔癀中3 個特征肽的含量穩定，各批間樣品均一性較好，其中多肽VAPLGEEFR 含量最高。本研究可為片仔癀的質量標準提升及含有動物藥藥味的中成藥質量分析提供參考。