基于網絡藥理學與分子對接的半夏瀉心湯治療腹瀉型腸易激綜合征作用機制研究△

潘世怡，高松林，吳美玲，鐘嘉圖，黃貴華

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；

2.廣西中醫藥大學 第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

腸易激綜合征（IBS）是一種長期發展，反復發作，以腹痛、腹部脹滿伴大便習慣及性狀變化為主要臨床特征的綜合征，屬于功能性胃腸道疾病[1]。羅馬Ⅲ診斷準則將IBS分為4個亞型，有腹瀉型（IBSD）、便秘型（IBS-C）、混合型（IBS-M）和未定型（IBS-U），以IBS-D 為主[2]。IBS-D 病因與病理機制復雜，可能與胃腸動力異常、腸-腦軸功能異常、內臟異常高敏感、腸道炎癥等有關，但其機制仍未完全明確[3]。因此，目前以口服促排泄、止瀉、解痙及抗抑郁等為主要治療方法。

中醫認為，IBS-D 可歸屬為泄瀉、腹痛范疇。中醫臨床多見肝氣郁滯、肝郁脾虛、脾腎虛寒、濕熱蘊結等證型，疾病發展過程會出現脾胃氣機升降異常、寒熱錯雜、虛實夾雜的病機變化，治療以疏肝解郁、疏肝健脾、溫中健脾、清利濕熱、調平寒熱等為主[4-7]。半夏瀉心湯由半夏、黃連、黃芩、人參、大棗、干姜、甘草組成，是張仲景創立的“辛開苦降、寒溫平調”治法中五瀉心湯的代表方之一，為后世所傳承活用，現多用于消化系統疾病。臨床運用半夏瀉心湯治療IBS-D 較為常見且具有較好的療效，可明顯改善患者癥狀[8-9]。藥理學研究表明，半夏瀉心湯可能通過調控膽堿能或5-羥色胺能神經從而對胃腸道運動起到雙向調節作用[10]。半夏瀉心湯治療IBS-D 安全、有效、復發率低[11]，但其發揮作用的具體分子機制尚未闡明。本研究采用網絡藥理學及分子對接技術研究半夏瀉心湯治療IBS-D 的作用機制，為其深入研究及臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 半夏瀉心湯活性成分篩選及作用靶點預測

使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[12]對半夏瀉心湯中各藥材活性成分和靶點進行收集及篩選。活性成分以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為依據[13]進行遴選。選擇“Related Targets”選項找出各活性成分的預測靶點。在UniProt數據庫[14]（https://www.uniprot.org/）中選定物種為“人”的靶點，將所有靶點名字都校正為標準基因名。

1.2 IBS-D靶點篩選

在GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]、OMIM（https://omim.org/）[16]、DrugBank（https://go.drugbank.com/）[17]、PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）[18]數據庫中以“diarrhea irritable bowel syndrome”為關鍵字搜索IBS-D 的疾病作用靶點，并對得到的靶點進行整理合并及刪除重復項。

1.3 藥物-活性成分-靶點網絡的繪制

利用微生信平臺，對藥物靶點與IBS-D 靶點提取重合部分，繪制韋恩圖，獲得半夏瀉心湯治療IBS-D 的可能作用靶點。使用Cytoscape 3.8.0 軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡，運用軟件工具中網絡分析儀進行拓撲學分析，根據節點度值（degree）篩選關鍵活性成分。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

在STRING 數據庫中輸入藥物與IBS-D 的共同靶點，選擇種類為“人”，建立PPI 網絡，設定最低互作打分為0.95 并隱藏脫離節點，其他均為默認設定，得到PPI 網絡信息與數據。輸出.TSV 格式文件，采用Cytoscape 3.8.0軟件的CytoNCA 插件進行拓撲學解析，通過調整節點連接度（DC）、中心度（BC）、特征向量中心度（EC）、緊密中心度、網絡中心度（NC）和基于局部均值量法中心性（LAC）參數篩檢出核心作用靶點，將PPI網絡可視化處理。

1.5 基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將半夏瀉心湯治療IBS-D 的靶基因導入至Metascape 數據庫，分析物種為人，選擇“Custom Analysis”。設定閾值P<0.01，進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。根據P值評估蛋白列表注釋功能的顯著性，選擇前10 個GO 功能和前20 個KEGG通路輸入到微生信平臺繪出富集氣泡圖。

1.6 分子對接

將核心活性成分作為小分子配體，從PubChem數據庫導出核心活性成分的2D 結構文件，輸入Chem 3D軟件將其調整為3D結構并優化Minimize能量，輸出為.mol2 格式文件。核心靶點作為大分子受體，從UniPort數據庫中搜索核心靶點對應蛋白的ID，再從PDB 數據庫篩選為人的物種、分辨率較高的核心靶點蛋白，下載蛋白的三維模型結構。在PyMOL 2.4.0 軟件中打開核心靶點蛋白，去除該蛋白水分子結構和原始小分子配體。將大分子導入AutoDockTools 1.5.7 軟件進行加氫、計算電荷數等處理，并將以上2 個文件轉變成.pdbqt 格式。利用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接，將對接結果通過PyMOL繪制成對接模型。

2 結果

2.1 半夏瀉心湯活性成分與作用靶點

在TCMSP 中依據OB>30%與DL>0.18 為條件篩選出半夏瀉心湯活性成分共211 個，其中半夏13個、人參22個、黃連14個、大棗29個、黃芩36個、干姜5 個、甘草92 個。活性成分包括槲皮素、金合歡素、漢黃芩素、千層紙素、山柰酚、甘草查耳酮A、黃芩素、異鼠李素、柚皮素等。在TCMSP 數據庫中檢索出3478 個半夏瀉心湯活性成分對應的靶點，通過UniProt數據庫將藥物靶點更改成標準基因名并去掉重復項，最后共得到99 個靶點，143 個活性化合物。

2.2 IBS-D 疾病靶點的收集及半夏瀉心湯治療IBSD潛在靶點

在OMIM、PharmGKB、GeneCards、DrugBank數據庫中共得到與疾病相關靶點2775 個，經剔除重復靶點剩余2545 個，與藥物靶點映射取交集，得到58 個靶點半夏瀉心湯治療IBS-D 的潛在靶點，見圖1。

2.3 藥物-活性成分-疾病靶點網絡分析

通過Cytoscape 軟件對58 個交集靶點構建藥物-活性成分-靶點網絡，該網絡有196 個節點，其中138個成分節點、58個靶點節點，646條邊，見圖2。在“Network analyzer”計算網絡中的拓撲參數，節點的度值越大則表明該節點可能是半夏瀉心湯治療IBS-D 的關鍵化合物或靶點。篩選出排序靠前的活性成分，見表1。

圖2 半夏瀉心湯治療IBS-D的藥物-活性成分-靶點網絡

由圖2可見，度值較高的靶標為熱休克90 kD 蛋白1（HSP90AA1）、雄激素受體（AR）、鈉通道蛋白5 型α亞基（SCN5A）、胰腺囊性纖維化基因（PRSS1）、細胞周期蛋白依賴激酶-2（CDK2）、β2-腎上腺素受體（ADRB2）、鉀電壓門控通道亞家族H 成員2（KCNH2）、毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型3（CHRM3）、B淋巴細胞瘤2（BCL2）等。

2.4 PPI網絡的構建及分析

半夏瀉心湯治療IBS-D 靶點的PPI 網絡有109 個節點和312條邊，見圖3A。使用Cytoscape里的插件計算網絡圖的拓撲參數，以DC、BC、EC、緊密中心度、NC 和LAC 值均大于其中位數作為篩選條件[19]，獲得網絡a（圖3B），按同樣的篩選步驟再次篩選得到核心網絡b（圖3C）。由核心網絡b 得到度值靠前的靶點有原癌基因蛋白Jun（JUN）、FOS、核轉錄因子-κB p65（RELA）、蛋白激酶B1（Akt1）、雌激素受體1（ESR1）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、MYC、缺氧誘導因子1-α（HIF1A）、細胞周期素依賴激酶抑制因子1A（CDKN1A）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、視網膜母細胞瘤蛋白1（RB1），這些靶點可能對半夏瀉心湯治療IBS-D起到關鍵作用。

圖3 半夏瀉心湯治療IBS-D的PPI網絡

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

GO 功能富集分析（P<0.01）中的生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）分別獲得1403、69、143 條。根據P值分別選擇排名前10 的條目繪制GO 功能分析圖（圖4）。BP 主要有細胞對化學應激、對氧化應激及對活性氧的反應等。CC主要涉及轉錄調控復合物、膜筏、膜微區等。MF主要有DNA 結合調控因子結合、轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合調控因子結合等。KEGG通路富集分析得出181條信號通路（P<0.01），排名前20的通路見圖5。

圖4 半夏瀉心湯治療IBS-D靶點的GO功能富集分析

圖5 半夏瀉心湯治療IBS-D靶點的KEGG通路富集分析

2.6 分子對接

選取度值最大的6個核心成分分別與PPI網絡中度值最大的6 個核心靶點進行分子對接，若配體與受體結合能≤–5.0 kcal·mol–1（1 cal≈4.186 J），則說明小分子配體與蛋白受體可以結合，且結合能越低則有越良好的結合能力。結果表明，核心靶點和成分結合能均≤–7.0 kcal·mol–1，見表2。部分活性成分和蛋白分子對接結果見圖6。

表2 半夏瀉心湯治療IBS-D關鍵成分和靶點的分子對接結果

圖6 半夏瀉心湯治療IBS-D關鍵成分和靶點的部分分子對接可視化圖

3 討論

本研究通過網絡藥理學及分子對接探討半夏瀉心湯治療IBS-D的分子作用機制。藥物-活性成分-靶點網絡提示半夏瀉心湯主要活性成分有槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、金合歡素、甘草查耳酮A、黃芩素、千層紙素、異鼠李素、柚皮素等。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗炎、降糖、抗癌、抗瘧疾等藥理作用，其通過調節下丘腦-垂體-腎上腺軸、調節神經化學釋放、增強腦源性神經因子、抑制腦氧化/氮能應激、神經炎癥及調控凋亡途徑，起到一定抗焦慮抑郁作用[20-22]。漢黃芩素提取自黃芩，具有抗氧化、抗炎、保護神經系統、抗癌等多種活性[23]，尤其是其能抑制脂多糖誘導巨噬細胞產生一氧化氮（NO），這可能是黃酮類化合物的抗炎作用機制[24]。山柰酚[25]、金合歡素[26-27]、查耳酮[28]屬于黃酮類化合物，有抗腫瘤，抑制炎癥反應、氧化應激反應等多種生物活性。研究證明，山柰酚可以減輕胃炎、胰腺炎和腹痛小鼠模型的炎癥損傷擴張，從而減輕炎癥、腹痛及扭體反應[29]。金合歡素可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 信號通路的激活改善胃腸動力障礙[30]。金合歡素還有神經保護、鎮痛和抑制單胺氧化酶的作用，Xiao 等[31]研究發現，金合歡素可能通過降低小鼠血清素和單胺氧化酶的活性起到抗抑郁作用。黃芩素是一種類黃酮，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、免疫調節、抗炎、抗病毒、抗癌等[32]。

通過PPI 網絡分析發現，JUN、FOS、RELA、Akt1、ESR1、CCND1、MYC、HIF1A、CDKN1A、MAPK1等為網絡的關鍵靶蛋白，可能在半夏瀉心湯治療IBS-D 的過程中起到關鍵作用。JUN 是一類轉錄調控因子，與調控細胞生存、繁殖、分化、凋亡和機體炎性反應等過程有密切聯系[33]。FOS 蛋白是即早基因c-fos的表達產物，JUN 與FOS 作為活化蛋白-1（AP-1）家族的主要成員，與癌癥、疼痛和抑郁有密切聯系[34-35]。c-fos基因可影響主體痛覺，在IBS 動物實驗模型中大腦的非同一處呈現強表達，提示c-fos基因影響IBS-D 的發生和轉歸。MARK1屬于MAPK 家族，是一種絲氨酸蛋白激酶，可調控炎性反應和細胞凋亡等，有研究推斷出MAPK-細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路可能使內臟異常敏感，引起IBS-D 的發生[36]。RELA 是核轉錄因子-κB（NF-κB）的成員，是miR-7 的目標基因，miR-7可使RELA 呈現低表達，從而影響NF-κB 通路的活性，抑制與細胞繁殖和凋亡相關的下行分子[37]，調控NF-κB 通路在治療IBS-D 中有重要作用。Akt1 對PI3K-Akt 信號通路可起到關鍵調控作用。PI3K 在該通路上游被活化出現肌醇，調節被磷酸化的Akt，再控制下游因子，影響如代謝、增殖、存活和生長的細胞周期進程。NO在信號通路末端，對胃腸肌肉收縮和運動有重要功能，其中NO 的調節酶正是PI3K-Akt信號通路中的內皮NO合成酶[38-39]。

通過富集分析發現，半夏瀉心湯參與細胞對化學應激的反應、對氧化應激的反應、對無機物的反應及對活性氧的反應、DNA 結合調控因子結合、轉錄因子結合、轉錄共調節因子結合等。KEGG 分析顯示半夏瀉心湯治療IBS-D 可能涉及癌癥通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、細胞凋亡、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、Toll 樣受體（TLR）信號通路、輔助性T 細胞17（Th17）細胞分化、細胞程序性死亡-配體1（PDL1）在腫瘤中的表達及PD-1檢查點通路、NF-κB 信號通路等多種通路。低度黏膜炎在IBS-D 的發生發展中起重要作用[40]。TLR 信號通路是公認的炎癥路徑。在應激背景下，該路徑中的受體活性特異，激發下行信號分子如NF-κB，促進炎性細胞和炎性損害物質的排出，產生各種炎性化學反應[41]。IL-17 有促炎性反應作用，IL-17 受體通過信號轉導結合體IL-17R-Act1-TRAF6 活化下游JNK、NF-κB 等通路[42]。NF-κB 信號通路可能是IBS-D 的腸道炎性反應和內臟高敏性形成的機制之一[43]。TNF 具有促炎性細胞作用，在調節組織器官穩態和炎癥反應中起著關鍵作用。IBS-D 發生時，環磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號通路被抑制，NF-κB信號通路活化，TNF-α表達增加[44]。有研究表明IBS-D大鼠血清及結腸TNF-α、IL-1β、IL-8 表達增加，艾灸干預干預能夠減少TNF-α、IL-1β、IL-8 表達，進而減少IBS-D大鼠腹瀉癥狀及內臟高敏感性[45]。

分子對接結果表明，半夏瀉心湯核心化合物與核心蛋白結合能較低，也一定程度上驗證了網絡藥理學預測結果。

綜上所述，半夏瀉心湯治療IBS-D 是一個涉及多成分、多靶點、多通路、多環節的疾病干預過程，治療過程中可能涉及JUN、FOS、RELA、Akt1、MAPK1 等核心靶點，通過調控IL-17、NF-κB、TLR、TNF等信號通道發揮作用。