多年生烏拉爾甘草復合叢枝菌根真菌接種效應研究△

汪金葉，王升，張燕，張乃嘦，楊明，小杉実加，孫楷*，郭蘭萍*

1.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；

2.中國中醫科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；

3.農業農村部 中藥材生物學與栽培重點實驗室，北京 100700；

4.德興市中醫研究院 試驗培訓基地，江西 德興 334220；

5.盛實百草藥業有限公司，天津 300301；

6.株式會社津村，日本 300-1192

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.（俗稱烏拉爾甘草）、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖[1]。其藥用歷史悠久，素有“十方九草，無草不成方”之稱[2-3]。甘草發揮臨床療效的物質基礎主要是黃酮類和三萜皂苷類化合物，其中甘草酸和甘草苷是評價甘草藥材質量的主要指標成分[4]。除了藥用，甘草還可用于干旱和半干旱地區退化生態系統的修復，在食品、日用化工及畜牧業等領域也有廣泛應用[5]。烏拉爾甘草是歷代甘草的主要藥材來源，其品質和藥效更佳。巨大的市場需求使野生烏拉爾甘草遭到過度采挖，資源面臨枯竭，人工栽培甘草成為目前甘草藥材商品市場供應的重要來源[6-8]。由于生長環境和生長期的不同，栽培與野生甘草藥材之間存在較大質量差異，人工栽培甘草有效成分含量難以達標，制約了甘草產業發展[9]。因此，加強烏拉爾甘草人工栽培技術研究，提高其藥材質量，是解決甘草資源匱乏的根本途徑[10]。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是廣泛存在于陸地生態系統土壤中的一類真菌，能侵染自然界中約90%維管植物的根系，與其建立互惠互利的菌根共生體[11]。AM真菌能通過該共生體系發揮諸多生理和生態功能，如促進植物生長發育、增強植物對養分和水分的吸收與利用、提高宿主植物的抗逆性和抗病性、改善土壤成分和肥力等[12-13]。在干旱地區接種AM 真菌可以增強植物在水分缺乏、養分貧瘠環境下的生存競爭能力[14]。AM真菌具有豐富的物種多樣性、功能多樣性和遺傳多樣性，近年來作為菌根生物肥料在農業、園藝和生態修復等領域得到較為廣泛的應用，其與藥用植物共生效應的研究也受到越來越多的關注[15-16]。大量研究表明，AM 真菌在藥用植物的生長發育、活性物質生物合成和積累及脅迫抗性等方面均發揮著積極作用[17]；接種AM 真菌能顯著促進甘草營養生長，以及干物質與有效成分的積累[18-20]。AM 真菌與甘草共生效應的深入研究對推進甘草生態種植和提高栽培甘草藥材的產量和質量具有重要意義。

現有研究多在室內盆栽條件下開展，受限于實驗室條件且栽培時間相對較短，尚未有大田條件下甘草長期菌根化育苗的研究報道。AM 真菌效應的發揮在田間可能受到AM 真菌種類、寄主、土壤環境與接種方法等諸多因素的影響，導致結果與室內盆栽研究產生差異，因此有必要開展田間試驗，為進一步探索甘草菌根化育苗技術和甘草多菌種聯合接種育苗提供科學依據。本研究以烏拉爾甘草為研究對象，選取摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae（Fm）與根內根孢囊霉Rhiaophagus intraradices（Ri）為接種的AM 真菌菌種，設置獨立與雙重接種試驗處理，在野外條件下進行了為期2 年的田間試驗，考察不同菌種與接種方式對甘草生長指標與甘草酸、甘草苷含量的影響，以期促進甘草生產中AM真菌菌劑的合理利用。

1 材料

1.1 甘草種子及菌劑

甘草種子采自內蒙古鄂爾多斯市杭錦旗，經中國中醫科學院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的種子，種子千粒質量為10～12 g，采用常規栽培管理。AM 真菌菌株摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae與根內根孢囊霉Rhiaophagus intraradices由長江大學吳強盛教授提供，使用“浙鳳糯3 號”玉米（浙江大學作物科學研究所）與瑞文德白三葉草（北京市種子公司）混合擴繁。

1.2 儀器

1260 型高效液相色譜系統（美國Agilent公司）；ME204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Pacific T-Ⅱ型超純水儀（美國Thermo 公司）；SB-800DTD 型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品甘草苷（批號：111610-201908，純度：95.0%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；磷酸、無水乙醇（分析純，天津市風船化學試劑科技公司）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；超純水為實驗室自制。

2 方法

2.1 試驗設計

試驗于內蒙古赤峰市喀喇沁旗甘草培育基地（N41°55′，E118°41′）進行。試驗地土壤基本理化性質見表1。設置單獨接種Ri、單獨接種Fm、復合接種Fm+Ri 和對照（CK），4 個菌劑接種試驗處理組。試驗采用完全隨機區組設計，每個處理設置5個重復，采用田間小區試驗，小區面積為4 m2，小區間設置隔離，播種密度為60 g/小區。AM 真菌在甘草播種時進行接種，將菌劑等量加入每個播種穴內，每克菌劑含孢子（50.0±9.7）個，每小區使用菌劑1 kg。雙重接種處理組中2 種菌劑等量混勻，所有接種處理組菌劑的總接種量保持一致。對照組加入等量經高溫滅菌的菌劑。接種后3 個月采用醋酸墨水染色法[21]染色、網格交叉法[22]與計數方法[23]統計侵染率，Fm 處理組的侵染率為（36.7±5.5）%、Ri 處理組的侵染率為（42.4±4.3）%、Fm+Ri 處理組的侵染率為（47.8±4.6）%，表明該方法能有效侵染菌根。

表1 甘草不同處理組土壤理化性質

2.2 生長指標測定

分別于播種后的第1 年9 月和第2 年9 月對甘草進行取樣，每個處理隨機取12 株，測定生長指標株高、主根長、根干質量、莖干質量與蘆頭直徑，取平均值。甘草株高、主根長采用鋼卷尺測量，蘆頭直徑采用游標卡尺測量，生物量采用天平稱量。

2.3 甘草酸和甘草苷含量測定

分別于播種后的第1 年9 月和第2 年9 月對甘草進行取樣，每個處理隨機取12 株，每4 株作為1 個混合樣，晾干，采用常溫、避光、防潮方式保存。樣品粉碎后過60 目篩，40 ℃烘烤48 h，按《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）甘草藥材【含量測定】項下方法[1]測定甘草酸和甘草苷含量。

2.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據錄入與整理，運用SPSS 18.0軟件進行數據分析。

3 結果

3.1 不同接種處理對甘草生長指標和生物量的影響

接種AM 真菌后，不同處理組間甘草的生長指標表現出一定差異（圖1）。第1 年，復合接種處理對甘草的株高、主根長、莖干質量、根干質量無顯著影響，單獨接種Ri 與單獨接種Fm 顯著降低了甘草的株高、莖干質量與蘆頭直徑，所有接種處理均顯著降低了甘草的蘆頭直徑。第2 年，除單獨接種Ri 與單獨接種Fm 顯著降低了甘草的株高外，其他處理組間株高、主根長、莖干質量、根干質量與蘆頭直徑差異無統計學意義。

圖1 不同AM真菌獨立與雙重接種對甘草生長的影響（,n=4）

各生長指標在不同處理組內的增長動態與規律存在差異。第2年，3個接種處理組甘草的主根長與根干質量與第1年相比均有顯著增長，而CK 增長不顯著。單獨接種的2 個處理組甘草的蘆頭直徑與第1 年相比均有顯著增長，復合接種組與CK 相比增長不顯著。與CK 相比，各處理組的株高、莖干質量均有顯著增長。

3.2 不同接種處理對甘草酸和甘草苷積累的影響

不同處理組間甘草酸與甘草苷含量有較大差異（圖2）。在接種的第1年，接種處理未顯著改變甘草的甘草苷含量；接種的第2 年，復合接種處理組甘草的甘草苷含量顯著高于CK，其次為單獨接種Fm處理，而單獨接種Ri 甘草的甘草苷含量與CK 差異無統計學意義。在接種的第1 年，所有接種處理組的甘草酸含量與CK 差異無統計學意義；接種的第2年，復合接種與單獨接種Fm處理組甘草的甘草酸含量顯著高于CK，而單獨接種Ri 處理組甘草苷含量顯著低于CK。在不同處理組內，甘草酸與甘草苷的積累動態存在差異。3 個接種處理組甘草酸與甘草苷含量較第1 年均有顯著增加，對照組甘草酸含量增加顯著，而甘草苷含量無顯著增加。

圖2 不同AM真菌獨立與雙重接種對甘草酸及甘草苷積累的影響（,n=4）

3.3 不同接種處理對甘草酸與甘草苷積累相關度的影響

與CK 相比，單獨接種Fm 處理組、單獨接種Ri處理組及復合接種處理組中2 年間甘草酸與甘草苷含量差異均有統計學意義（P<0.001，圖3），表明接種AM 真菌處理后，甘草酸與甘草苷積累保持了穩定的成比例線性增長關系。在不同接種處理下，甘草酸與甘草苷線性關系的斜率差異有統計學意義（P<0.001）。

圖3 不同AM真菌獨立與雙重接種處理下甘草酸及甘草苷的線性分析

3.4 不同接種處理對甘草苷含量與甘草酸含量比值（苷酸比）的影響

不同處理組的苷酸比相比CK均有顯著提高，且增長程度差異有統計學意義（P<0.05，圖4）。其中，單獨接種Ri處理組對甘草的苷酸比提升最為明顯，其次為復合接種處理組，再次為單獨接種Fm處理組。

圖4 不同AM真菌獨立與雙重接種對苷酸比的影響（,n=4）

4 討論

本研究結果表明，在大田條件下復合接種Fm與Ri 可以顯著提升烏拉爾甘草中甘草酸與甘草苷的含量，有助于甘草品質的提升。Amanifer 等[24]發現，實驗室條件下單獨接種Fm能促進光果甘草植株的生長并增加甘草酸的含量；Xie等[25]的室內研究試驗表明，單獨接種Ri 可以促進甘草生長和增加甘草酸和甘草苷的積累；Liu 等[26]發現，Fm 與地表球囊霉混合接種可以促進甘草生長和甘草酸積累，但兩者并非協同作用；王振楠等[27]研究發現，Fm 與Ri混合接種對促進紅花生長和產量增加效果最好；Zubek等[28]發現，Fm 與異型根孢囊霉Rhizophagus irregularis混合接種可增加三色堇中黃酮類化合物含量；還有研究表明，Fm 與Ri 在提高酚類物質含量上具有協同效應[29]。然而，此前尚未有研究對甘草雙重接種Fm與Ri 的效果進行探究，甘草接種AM 真菌后在田間的長期真實效果也尚未見報道。本研究證實了大田條件下，Fm 與Ri 雙重接種對甘草酸和甘草苷的積累有協同促進作用。

本研究中2種AM真菌雙重接種的協同增效可能與不同菌種間的功能互補有關。前人研究表明，AM真菌的不同分類群具有功能互補性，在混合接種時產生協同作用[30]。Koide 等[31]提出，根部AM 真菌菌種間存在磷吸收的功能互補；Jansa 等[32]發現，接種根內球囊霉和近明球囊霉Claroideoglomus claroideum對韭蔥磷吸收促進作用優于單接種，認為AM 真菌之間的協同作用可能是基于真菌對磷吸收的差異；李響[33]研究表明，盆栽條件下Fm與Ri混合接種相比單獨接種能更好地促進毛紅椿幼苗生長和提高氮、磷、鉀吸收量；Crossay 等[34]發現，來自不同類群的AM 真菌混合接種比單一接種能更有效地提高植物生物量、礦物質營養、鈣鎂比和對重金屬的耐受性。另外，具有協同作用的AM 真菌群落還可更好地促進土壤團聚體穩定性，繼而可改善土壤營養狀況[35]。相較單菌種接種，具有協同互補作用的2種AM真菌菌劑聯用在生產中可能更具備優勢。

本研究進行了大田條件下甘草2種AM真菌的雙重接種，但大田試驗存在多種不可控因素對宿主植物產生不確定影響，引入更多種AM 真菌混合接種或AM 真菌與根瘤菌（rhizobium）聯用是否對大田條件下產量品質的穩定提高有更佳的作用尚待探索。大田中復雜的土壤理化性質、微生物環境及氣象因素等都可能導致大田試驗結果異于室內盆栽試驗。首先，大田中植物可利用土壤資源相對較大，有利于植物的營養獲取，不利于AM 真菌改善營養作用的體現[36]；其次，試驗期內較多的降水可導致AM真菌緩解干旱脅迫的作用無法充分展現[37]；此外，Verbruggen 等[38]認為，物種兼容性、田間承載能力和優先效應是影響AM真菌對植物作用的3個決定性因素。復雜菌劑可能更有利于在大田條件下形成優勢，如有研究表明接種4 種或6 種AM 真菌的混合菌劑后，滇重樓和木香的生長發育與有效成分含量均得到顯著提升[39-40]；Liu等[41]發現，含有6種球囊霉混合菌劑聯合作用可以增加甘草地上部和根部干質量；干旱脅迫下，AM 真菌和根瘤菌共同接種可以更有效地促進甘草生長和提高抗旱能力[42]。未來，研制低價高效、性效穩定的甘草專用多菌聯用菌劑是一個重要方向。

本研究發現，接種AM 真菌后，烏拉爾甘草中甘草酸與甘草苷的比例發生了顯著變化，具體表現為甘草苷相對比例的顯著增加。同時，在2 年的栽培中，所有接種組甘草苷與甘草酸的積累速率均維持較為穩定的增長，并與CK 形成明顯差異。前人研究發現，栽培甘草中甘草酸與甘草苷呈正相關，但隨著生長年限增加，甘草苷與甘草酸的比例呈逐年下降趨勢，表明甘草苷較甘草酸更難積累[43]。Xie等[25]的研究也表明，接種Ri 可提高甘草苷與甘草酸的比值。此外有研究發現，接種AM 真菌可改變茅蒼術揮發油中蒼術醇、β-桉葉油醇及蒼術素和廣藿香揮發油中廣藿香醇及δ-愈創木烯的相對百分含量，促進主要有效成分的積累，從而提高品質和產量[44-45]。接種AM 真菌對甘草中苷酸比有提升作用，有助于提高甘草的質量。目前對于AM 真菌如何改變苷酸比的機制尚未明確，有待進一步研究。

本研究探索了Fm 與Ri 2 種AM 真菌對于甘草種苗生長與有效成分積累的影響，發現大田條件下復合接種對甘草酸和甘草苷的積累有協同促進作用。目前，僅觀察到AM 真菌復合接種的效果，其協同增效的機制還有待于進一步研究。本研究成果為甘草生產中AM真菌菌劑的合理利用提供了參考。