芪丹方主成分抑制肝星狀細(xì)胞增殖及最佳配伍劑量△

董人華，徐煥煥，王秀麗*，李耿，曲舒顯

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

肝纖維化與肝臟的慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是多數(shù)慢性肝病發(fā)展為肝硬化共同的必經(jīng)病理階段。現(xiàn)代研究表明，肝纖維化是由于肝膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增殖和降解處于失衡狀態(tài)，導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織異常沉積的可逆病理過程。ECM的分子來源包括肝星狀細(xì)胞（HSC）、骨髓前體細(xì)胞和門脈肌成纖維細(xì)胞。HSC 是肝纖維化過程中產(chǎn)生ECM 的主要細(xì)胞，多種細(xì)胞因子可激活HSC，促進(jìn)ECM 的合成、分泌和沉積，導(dǎo)致肝纖維化的形成[1-4]。因此，抗肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是抑制HSC 的活化及抑制活化HSC的增殖。

芪丹方由丹參、黃芪、甘草、虎杖組成，是臨床治療肝纖維化的有效藥物。其主要有效成分為丹酚酸B（Sal B）、丹參酮ⅡA（TSN）、黃芪甲苷（AsA）、甘草次酸（GA）和白藜蘆醇（Res），據(jù)文獻(xiàn)報道，這些有效成分均能抑制HSC 的增殖。TSN是丹參中的脂溶性活性成分，覃筱燕等[5]研究了TSN對抗CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，結(jié)果表明TSN 可降低大鼠血清中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）和羥脯氨酸（Hyp）的含量，減輕肝纖維化的病理損傷，降低肝臟轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和α-平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達(dá)；Sal B是丹參的水溶性活性成分，體外實驗表明，其能抑制HSC 的增殖和膠原生成，抑制TGF-β1的自分泌，抑制絲裂原活化蛋白激酶（MARK）活性及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號，減少HSC 中Ⅰ型膠原的合成和分泌[6-7]；張其勝等[8]使用GA 治療肝纖維化，結(jié)果顯示，患者服用GA 后，肝臟中的膠原沉積顯著減少，Ⅰ型膠原和α-SMA mRNA 的表達(dá)顯著降低；Res 是一種直接抑制炎癥反應(yīng)的炎癥抑制因子，在肝損傷過程中，其可以逆轉(zhuǎn)由腫瘤壞死因子（TNF）-α、纖溶酶原激活物抑制劑（PAL）-1和動脈粥樣硬化因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素（IL）-6的分泌，抑制炎癥反應(yīng)，改善損傷程度[9-10]。此外，Res可抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[11]；AsA可抑制纖維組織增生和肝組織纖維化，并降低肝組織中TGF-β和Smad-3蛋白的表達(dá)，提示AsA 可能通過調(diào)節(jié)TGF-β和Smad-3蛋白來改善肝損傷[12]。

本研究比較Sal B、TSN、Res、AsA 和GA 在不同配伍比例下對肝纖維化的治療作用，從處方中篩選出各有效成分的最佳配伍比例，以期簡化處方、提高藥效，為開發(fā)新藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

MCO-18AIC型（UV）CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高壓滅菌器（日本SANYO 公司）；3-18K Sartorius 型離心機(jī)（德國Sigma-Aldrich 公司）；ECLIPSE TS10 型顯微鏡（日本尼康公司）；KS4000ic 型控溫?fù)u床（德國IKA 公司）；SpectraMax M2 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；KQ5200 型超聲波儀（昆山超聲波儀器有限公司）；Barnstead GenPure Pro 型超純水系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

HSC（北京望京醫(yī)院病理科）；DMEM（含4.5 g·L–1葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉，美國康寧生命科學(xué)公司，批號：10013649R）；胎牛血清（FBS，批號：41Q470K）、胰蛋白酶（批號：25200056）均購自美國Gibco 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Lyclone 公司，批號：NAB1338）；甲基噻唑基二苯基四唑溴化銨（MTT，碧云天生物科技有限公司，批號：ST315）；二甲基亞砜（DMSO，德國Sigma-Aldrich 公司，批號：037K07662）；乙二胺四乙酸（EDTA，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）；CuSO4（批號：F20110301）、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4（批號：D0060421）均購自北京化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（批號：20110418）、氯化鉀（批號：20110126）均購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GA（批號：111215，純度>98%）、TSN（批號：120428，純度>98%）、Sal B（批號：12020104，純度>98%）、AsA（批號：130126，純度>98%）、Res（批號：130213，純度>98%）均購自中國寶雞市國康生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HSC 細(xì)胞系置于含10% FBS 的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的濕空氣中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長后24 h 內(nèi)傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定生長融合達(dá)到80%時，用胰蛋白酶消化后按濃度接種至培養(yǎng)板。

2.2 MTT測定

取處于對數(shù)生長期的HSC細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按5×103個/mL 的密度接種于96孔板中，并在37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h。去除上清液后，加入不含F(xiàn)BS的DMEM 培養(yǎng)24 h。每孔加入液體（Sal B、TSN、Res、AsA 和GA）200 μL 后，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，每個孔中添加 MTT 200 μL（MTT∶DMEM=1∶10），在37 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，去除上清液，加入DMSO 150 μL，在560 nm 處檢測吸光度值（A）。按公式（1）計算增殖抑制率（PI）。

式中A0為空白組吸光度值，A1為對照組吸光度值，A2為藥物組吸光度值。

2.3 響應(yīng)面法設(shè)計

采用響應(yīng)面法研究4 個變量對增殖抑制的影響，對TSN 濃度（A）、Sal B 濃度（B）、GA 濃度（C）、AsA濃度（D）進(jìn)行了優(yōu)化（表1）。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化芪丹方中4個主成分抑制HSC增殖試驗設(shè)計因素與水平

表2 TSN不同給藥濃度抑制HSC增殖的結(jié)果（n=3）

2.4 統(tǒng)計分析

采用Design-Expert 8.0.6 對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。除另說明外，所有實驗均重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測定給藥濃度

采用MTT 法研究了TSN、Sal B、Res、AsA 和GA 在不同濃度下對HSC 增殖的抑制作用。結(jié)果見表3～表6、圖1。

圖1 不同給藥濃度芪丹方主成分與HSC的PI柱狀關(guān)系圖（,n=6）

表3 Sal B不同給藥濃度抑制HSC增殖的結(jié)果（n=3）

表4 GA不同給藥濃度抑制HSC增殖的結(jié)果（n=3）

表6 Res不同給藥濃度抑制HSC增殖的結(jié)果（n=3）

從表2～表6、圖1 可以看出，TSN、Sal B、Res、AsA 和GA 均能抑制HSC 的增殖，且濃度和抑制率存在相關(guān)性。

半抑制濃度為藥物對細(xì)胞增殖的抑制效果達(dá)到細(xì)胞正常增殖水平50%時的給藥濃度，該值可反映藥物對HSC 增殖的抑制作用，半抑制濃度越低藥物抑制細(xì)胞增殖的作用就越強(qiáng)。使用GraphPad Prism 5軟件繪制對數(shù)濃度與GI之間的關(guān)系（圖2）。

圖2 芪丹方5種主成分給藥濃度對數(shù)和HSC生長抑制率的曲線關(guān)系圖

從圖2 中可以看出，TSN 的半抑制濃度為12.30 μmol·L–1，Sal B的半抑制濃度為22.68 μmol·L–1，其濃度>TSN，表明Sal B 的抑制作用弱于TSN。GA 的半抑制濃度為25.56 μmol·L–1，AsA 為26.20 μmol·L–1，Res為86.50 μmol·L–1。

從以上結(jié)果可以看出，TSN 的抑制作用最強(qiáng)，其次是Sal B、GA、AsA，Res 抑制作用最弱，且半抑制濃度過高，不具備實際應(yīng)用的價值。因此，對Sal B、TSN、AsA和GA進(jìn)行了響應(yīng)面試驗。

3.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 法設(shè)計方案進(jìn)行試驗，測定A、B、C、D 這4 個變量對HSC 增殖抑制的影響，計算綜合評分，響應(yīng)試驗結(jié)果見表7。

表7 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化芪丹方中4個主成分抑制HSC增殖試驗設(shè)計與結(jié)果

3.3 擬合響應(yīng)面模型

根據(jù)表7 的結(jié)果，進(jìn)行回歸分析。回歸方程為Y=16.278 67A+10.663 46B+0.871 47C+8.096 21D–0.184 68AC–0.290 24CD–1.108 45A2–0.522 63B2+0.332 91C2– 0.376 40D2– 36.535 77（r=0.957 2）。回歸方程具有顯著性和代表性。

通過擬合方程可得，TSN、Sal B 和AsA 的濃度對HSC 的PI 有很大影響，而GA 的濃度在聯(lián)合配伍中幾乎無影響，可忽略。從結(jié)果可知，給藥濃度為10 μmol ·L–1時，對HSC 增殖抑制作用最強(qiáng)的TSN的抑制率僅為24.19%，而聯(lián)合用藥后對HSC 增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)。

3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化的配伍結(jié)果

如圖3、圖4 所示，同時給予TSN 和Sal B 時對HSC增殖的抑制率最高。

圖3 AB、AC、AD對HSC的GI影響響應(yīng)面和等高線圖

圖4 BC、BD、CD對HSC的GI影響響應(yīng)面和等高線圖

根據(jù)上述分析，采用軟件優(yōu)化得到的最佳處方為TSN∶Sal B∶AsA=5.57∶5.96∶5.55（摩爾比），細(xì)胞PI為97.45%。

4 討論

4.1 助溶劑的選擇

在MTT 法中，研究了5 種藥物的溶出性。Sal B具有水溶性，可被培養(yǎng)基溶解。TSN、Res、GA 和AsA 是親脂性成分，DMEM 在細(xì)胞培養(yǎng)中難以溶解。因此，有必要添加助溶劑來幫助溶解。脂溶性溶劑有很多種，常用的有乙醇、聚山梨酯-80 和DMSO[13]。乙醇可以在較高濃度下溶解藥物，但細(xì)胞毒性很強(qiáng)、易揮發(fā)、容易導(dǎo)致藥物沉淀；聚山梨酯-80是一種非離子表面活性劑，可與細(xì)胞膜相互作用并協(xié)助藥物擴(kuò)散，但在低濃度下可損傷細(xì)胞。有研究者還使用羧甲基纖維素、乙酸乙酯，但效果不佳[14]。DMSO 能溶解多種藥物，具有雙極性、低細(xì)胞毒性、與細(xì)胞膜親和力高的特點，并能協(xié)助藥物穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)迅速均勻分布[15]。在本研究中，DMSO 對TSN 和AsA 的溶解度明顯優(yōu)于其他2組溶劑，且對GA 和Res 的溶解度良好，因此選擇DMSO作為助溶劑。

研究表明，體積分?jǐn)?shù)>0.5%的DMSO會引起細(xì)胞毒性，而低濃度的DMSO作為脂溶性藥物的溶劑是安全可行的[16]。因此，筆者研究了DMSO在4種藥物中的溶解度。結(jié)果表明DMSO對GA和Res的溶解較好，DMSO 20 μL可完全溶解GA1 mg，DMSO 40 μL可完全溶解1 mg Res；TSN 和AsA 不易溶解，可采用超聲波法溶解。

4.2 復(fù)方中藥配伍應(yīng)用的優(yōu)勢

聯(lián)合治療是指同時使用2 種或2 種以上的藥物，協(xié)同作用是指聯(lián)合用藥后，治療效果提高，不良反應(yīng)減弱或消除。聯(lián)合治療可以降低耐藥的可能性，提高藥物的抗菌活性，降低毒性，擴(kuò)大治療范圍。中藥配伍可以充分發(fā)揮藥物的相互作用，最大限度地發(fā)揮療效。例如，六神丸中麝香、牛黃和蟾蜍單獨(dú)抗炎的作用很小，很難治愈患者，但若將3 種中藥制成六神丸，可最大化發(fā)揮抗炎作用[17]。在張仲景的五苓散中，蒼術(shù)、茯苓、澤瀉的利尿作用較差，三藥合用效果不顯著。但加入桂枝后，利尿效果明顯改善，說明中藥配伍的重要性[18]。

中藥復(fù)方體系的療效是天然藥物中單體化合物協(xié)同多靶點作用的結(jié)果，這不僅僅是藥物單靶點作用的疊加，更是藥物組合形成的交互正負(fù)反饋信號放大和減弱的協(xié)同效應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為，有效藥物的合理配伍可達(dá)到最佳的療效，并可減小不良反應(yīng)。許多嚴(yán)重疾病，如癌癥，其病因復(fù)雜，屬于多靶點疾病。多靶點聯(lián)合用藥比單靶點用藥更容易達(dá)到治療目的，藥物組合可以產(chǎn)生多層次的相互作用，最終表現(xiàn)出協(xié)同、相加或拮抗作用。多藥聯(lián)合的動機(jī)，如疾病的治療需要針對多個環(huán)節(jié)或目標(biāo)，患者常患多種疾病，除病因治療外，還需對癥治療；藥物的適應(yīng)證和治療窗口有限，具有不同性質(zhì)和不同程度的不良反應(yīng)。因此，聯(lián)合用藥的目的是獲得最大的治療效果，并盡量減少不良反應(yīng)。對于惡性腫瘤、傳染病、心腦血管疾病等嚴(yán)重疾病的治療，聯(lián)合用藥的療效非常顯著。從解決問題的可行性和實際效果來看，聯(lián)合用藥或復(fù)方新藥的開發(fā)可為疾病治療和新藥開發(fā)開辟更廣闊的道路。

5 結(jié)論

綜上，本研究證實芪丹方中的主要有效成分Sal B、TSN、AsA、GA 和Res 均可抑制肝HSC 的增殖，并呈濃度依賴性。聯(lián)合配伍用藥時，特別是TSN、Sal B和AsA 的聯(lián)用可明顯增強(qiáng)對HSC 增殖的抑制作用。同時，只有選擇合適的配伍劑量，才能達(dá)到抑制HSC 增殖的最優(yōu)藥效作用。最終篩選出的芪丹方主要有效成分的最佳配伍比例可為芪丹方中成分的配伍、提取及藥效的應(yīng)用等提供參考。