甘草次酸衍生物配體18-GA-Ala介導脂質體的制備及肝靶向性研究△

金粟，顧蘅，董人華，王秀麗*，李耿，曲舒顯

1.北京中醫藥大學，北京 100102；

2.昆明市中醫醫院 中藥房，云南 昆明 650011；

3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

肝纖維化是指在各種因素的影響下，肝臟持續受損，肝星狀細胞（HSC）被誘導激活轉變為肌成纖維細胞，進而過量分泌細胞外基質，最終導致肝臟纖維化的過程。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化及肝癌發展的關鍵環節，因此早期干預并逆轉肝纖維化對阻止肝病的進一步發展非常重要。目前，西醫尚無療效確切的抗肝纖維化藥物，而一些單味中藥、中藥單體或復方可作用于肝纖維化發病機制中的多個環節，發揮綜合的抑制作用，顯著阻止或逆轉肝纖維化的進展[1]。

丹參為藥用植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，歸心、肝經，性微寒，味苦，具活血通絡、清心除煩、涼血消癰等功效，臨床上常用于心血管系統疾病、神經系統疾病、肝纖維化及腫瘤等疾病的治療。在丹參的諸多化學成分中，丹參酮ⅡA（TSN）為最主要的脂溶性成分，丹酚酸B（Sal B）為最主要的水溶性成分，兩者的含量最高，活性也最強。TSN 可通過靶向Smad6/7 蛋白、HSC及內源性干細胞，Sal B 可通過靶向凋亡蛋白胱天蛋白酶9（Cleaved Caspase-9）、轉化生長因子（TGF）-β1及轉錄因子MEF2 等來阻止肝纖維化的發生和發展，兩者已被證實具有確切的抗肝纖維化療效[2-3]。但TSN 在水中的溶解性較差，Sal B 性質不穩定且入血后易降解，兩者生物利用度均不高[4]。

脂質體與肝臟親和性高，靜脈給藥后可被動靶向網狀內皮系統最發達的肝臟，同時脂質體無毒、無免疫原性、可生物降解，生物相容性好。并且脂質體具有結構封閉、可保護藥物、提高藥物穩定性、有效控制藥物釋放、降低藥物不良反應、提高藥物生物利用度等諸多優點，被廣泛用于靶向給藥系統及肝病的治療[4-8]。另外，肝實質細胞表面存在大量特異性甘草次酸結合位點，含有甘草次酸或甘草次酸衍生物的藥物載體在體內具有明顯的主動肝靶向作用[9-14]。

因此，本研究將以甘草次酸為基本母核，合成親水性增強的肝靶向配體丙氨酸丁二酸甘草次酸十八烷酯（18-GA-Ala）。將模型藥物的Sal B 和TSN包埋在脂質體后，研究其在小鼠體內的藥動學及組織分布情況，評價配體18-GA-Ala 修飾對脂質體的肝靶向作用，以期獲得主動與被動相結合的肝靶向制劑，將藥物有效濃集于肝臟，提高藥物治療指數，降低藥品不良反應，提高藥物生物利用度，為治療肝纖維化等肝組織靶向藥物的開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY I-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BSl10S型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；RW-2000A 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SCIENTZ-ⅡD 型超聲波細胞粉碎機、S10 型高速勻漿機均購于浙江新芝有限公司；Zetasize Nano ZS 型納米粒度儀（英國Malvern 公司）；JEM-1230 型透射電鏡（日本JEOL 公司）；G16 型醫用高速離心機（白洋離心機廠）；Ultracel YM-100 型超濾管（美國Millipore 公司）；Barnstead GenPure Pro 型超純水系統（美國Thermo Fisher 公司）；Qilinbeier?VORTEX-5 型渦旋混合儀（北京東南儀誠實驗室設備有限公司）；TTL-DC 型多功能氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）；KQ5200DE 型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品Sal B（批號：10113-081107，純度>98%）、TSN（批號：110766-200417，純度>98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；配體18-GA-Ala[自合成，甘草次酸（GA，寶雞國康生物科技有限公司，批號：111215，純度>98%）、丁二酸酐（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20101208）、丙氨酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：140680-201604）、硬脂酸（天津市光復精細化工研究所，批號：20200923）]；大豆磷脂（德國Lipoid公司，批號：01/2015，純度>94%）；膽固醇（美國Amresco公司，批號：0433，超純級）；娃哈哈純凈水；甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

無特定病原體（SPF）級昆明種小鼠100 只，雄性，5周齡，體質量（20±2）g，購于北京斯倍福實驗動物科技有限公司，合格證號：SCXK京2016-0002，動物倫理批準號：BUCM-4-2016011003-1003。

2 方法

2.1 18-GA-Ala的合成工藝

甘草次酸與硬脂醇經酯化反應生成甘草次酸十八醇酯（18-GA）；18-GA 與丁二酸酐酰化反應后，合成丁二酸甘草次酸十八烷酯（18-GA-Suc）；18-GA-Suc 與丙氨酸反應得到18-GA-Ala（分子式：C55H91NO8，相對分子質量：893.67）。18-GA-Ala 的結構式和工藝見圖1。

圖1 18-GA-Ala的結構式及合成工藝

2.2 脂質體的制備

稱量TSN、配體18-GA-Ala、磷脂（SPC）和膽固醇（CH，SPC 與CH 的質量比為6∶1，SPC 與TSN 的質量比為30∶1），超聲共溶于無水乙醇中。在30 ℃條件下，真空蒸發去除有機溶劑，于圓底燒瓶內壁形成均勻薄膜。隨后使用超聲波儀，用少量去離子水水合脂質膜，分離瓶壁的脂質體。經過380 W探頭超聲勻化后，用高速勻漿機進行均質處理，隨后逐滴加入Sal B的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液（pH=3.32），充分混合后，30 ℃條件下水浴30 min。最終獲得含有配體18-GA-Ala 的復方脂質體18-GA-Ala 修飾的TSN-Sal B（Ala-TS-lip）。

TSN-Sal B 脂質體（TS-lip）的制備方法與Ala-TS-lip的制備方法類似，但未添加配體18-GA-Ala。

2.3 脂質體的表征

2.3.1 脂質體的粒徑分布、電位測定及形態觀察25 ℃條件下，采用Zetasize Nano ZS 型納米粒度儀測量脂質體的粒徑、多分散系數（PDI）和電位：吸取待測定脂質體混懸液80 μL 于離心管中，超純水稀釋100 倍，混合均勻。使用氦激光作為光源收集動態光散射數據，并通過光子相關光譜提供平均結果。

通過透射電子顯微鏡檢測Ala-TS-lip的形態：將樣品稀釋25倍后，滴于銅網表面，靜置15 min，濾紙吸干多余水分，采用2%的磷鎢酸負染色3 min，觀察并拍照。

2.3.2 包封率及載藥量測定 為了測定包封率，使用適當體積的甲醇破壞分散脂質體，通過超高效液相色譜法（UPLC）測定18-GA-Ala、TSN和Sal-B的總藥物含量；將脂質體于2000 r·min–1離心（離心半徑為8.6 cm）5 min，取上清液并用甲醇分散，分別檢測TSN和18-GA-Ala的含量，記錄為TSN的質量（WTSN）和W18-GA-Ala；將脂質體在15 000 r·min–1下離心（離心半徑為8.6 cm）30 min，取上清液400 μL 置超濾管中在6000 r·min–1下離心（離心半徑為8.6 cm）30 min，提取超濾液100 μL與甲醇100 μL超聲混合，測定Sal B的含量，并記錄為WSalB。按公式（1）～公式（3）計算藥物包封率（EE）[15-16]。

2.4 藥動學和組織分布研究

2.4.1 給藥和取樣 將100 只小鼠隨機分為TS-lip組和Ala-TS-lip 組，每組50 只小鼠，共分為10 個時間點，1個時間點5只。給藥前小鼠禁食12 h，自由飲水。一組通過尾靜脈注射給予Ala-TS-lip 脂質體（0.25 mL/只），折合小鼠體質量Sal B、TSN 給藥劑量分別為48.25、4.88 mg·kg–1；而另一組以相同劑量和相同方式給予TS-lip 脂質體。于給藥后5、10、20、30、45 min 和1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h 摘眼球取血，收集心、肺、肝、脾、腎組織，用0.9%氯化鈉溶液洗凈所有組織樣本表面的血液，濾紙吸干，于–20 ℃下儲存。

2.4.2 組織樣本處理 自然解凍組織樣本，剪碎，加入1.5 倍的0.9%氯化鈉溶液后，制備組織勻漿。分別將小鼠心、肺和脾組織全量及肝、腎組織勻漿液500 μL移取至離心管中，向組織勻漿中加入甲酸-水（1∶3）混合溶液（肝、腎：70 μL，脾、肺、心臟：50 μL），并精密加入氯霉素（作為內標物）10 μL。向提取物中加入乙酸乙酯1 mL，渦旋3 min，并在15 000 r· min–1下離心（離心半徑為8.6 cm）10 min，沉淀蛋白質。將上清液移取至另一個離心管中，殘留物與乙酸乙酯1 mL混合，再次如上所述渦旋離心提取藥物。將2次提取的上清液合并后，采用氮氣在37 ℃的水浴條件下吹干溶劑。用甲醇100 μL重新溶解殘留物，渦旋1 min 后15 000 r·min–1離心（離心半徑為8.6 cm）10 min。取樣品1 μL，采用UPLC進行分析。

2.4.3 UPLC 分析 色譜分析條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～1.5 min，20%～25%A；1.5～3.0 min，25%～64%A；3.0～5.1 min，64%A；5.1～5.8 min，64%～90%A；5.8～6.0 min，90%～20%A）；流速：0.4 mL·min–1；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測器（PDA）監測，檢測波長：Sal B為289 nm，TSN為265 nm；進樣量：1 μL。

2.4.4 數據分析 采用 DAS 3.2 軟件，按非房室模型計算Sal B和TSN的組織分布含量；繪制血藥濃度-時間曲線，采用SAS 8.1 分析統計數據，采用t檢驗兩兩比較分析，多組間采用One-way ANOVA方差分析法比較分析；繪制各組組織的藥物濃度-時間柱形圖，比較脂質體在小鼠體內的靶向作用。計算相對攝取率（RE）、最大峰濃度之比（CE）和靶向效率（TE），評價靶向性。

3 結果

3.1 脂質體的表征

由圖2 可知，脂質體形狀為均勻圓形，粒徑為150～200 nm。表1 顯示了TS-lip 和Ala-TS-lip 的包封率、粒徑、電位、PDI和結合率。

表1 TS-lip和Ala-TS-lip的理化性質（,n=5）

表1 TS-lip和Ala-TS-lip的理化性質（,n=5）

注：—表示該項未檢測。

圖2 Ala-TS-lip透射電鏡圖（×25 000）

3.2 UPLC檢測結果

如圖3 所示，主要峰成分被完全分離，故可通過光譜圖進行鑒別和分析。

圖3 Sal B、TSN和18-GA-Ala的UPLC圖

3.3 器官中藥物的標準曲線

根據相關研究[4-6]，各器官中Sal B和TSN的標準曲線見表2、表3。

表2 小鼠組織中Sal B的標準曲線

表3 小鼠組織中TSN的標準曲線

3.4 組織分布

給藥后，不同時間點Sal B 和TSN 在2 組小鼠器官中的分布情況見圖4、圖5。

圖4 靜脈注射Ala-TS-lip和TS-lip后不同時間點Sal B在小鼠器官中的分布

圖5 靜脈注射Ala-TS-lip和TS-lip后不同時間點TSN在小鼠器官中的分布

如圖4 所示，與TS-lip 組相比，給予Ala-TS-lip時，肝臟中Sal B的濃度明顯升高，說明肝細胞靶向配體18-GA-Ala 可以將包埋的親水性藥物Sal B 帶入肝臟。此外，在2 組小鼠的脾、肺中均檢測到豐富的Sal B，這可能和脂質體的被動靶向性相關。

從圖5 可以看出，Ala-TS-lip 組與TS-lip 組的TSN 在肝臟中的積累差異有統計學意義，前者的TSN 濃度較高。在給藥60 min 后Ala-TS-lip 組可檢測到TSN，而TS-lip 組給藥30 min 后檢測不到TSN。結果表明，配體可以將親脂性藥物TSN 靶向到肝臟，并能提高TSN的穩定性。

3.5 TS-lip和Ala-TS-lip對肝臟靶向性的評價

按公式（4）～公式（6）計算RE、CE 和TE，可評價TS-lip 和Ala-TS-lip 對肝臟的靶向能力[17]，結果見表4、表5。

表4 Ala-TS-lip和TS-lip在肝臟中的AUC和Cmax的比較（,n=5）

表4 Ala-TS-lip和TS-lip在肝臟中的AUC和Cmax的比較（,n=5）

注：與TS-lip組比較，**P<0.01。

表5 Ala-TS-lip在肝臟與其他組織的TE的比較（n=5）

式中Cmax為最大峰濃度，AUC 為藥時曲線下面積。

由表4可知，比較2組小鼠肝組織中Sal B和TSN的RE，水溶性成分Sal B 在Ala-TS-lip 組和TS-lip 組的肝臟中均無相對增加，差異無統計學意義。而Ala-TS-lip 組肝組織中的TSN 是TS-lip 組的25.25 倍，表明配體18-GA-Ala 修飾后可增強TSN 對肝的靶向，實現對肝組織的靶向作用。Sal B和TSN 對肝靶向的差異推測可能是脂溶性TSN 與磷脂雙分子層的連接比水溶性Sal B 更緊密，從而實現肝組織的靶向能力。

2 組小鼠肝組織中Sal B 和TSN 的CE 的比較結果顯示，Ala-TS-lip 組在肝組織中的Sal B 和TSN 含量分別為TS-lip組的39.99、16.70倍，Ala-TS-lip組在肝組織中的Sal B 和TSN 多于TS-lip 組，說明配體18-GA-Ala 修飾的脂質體可以提高肝組織中Sal-B 和TSN的峰濃度。

由表5可知，Ala-TS-lip組TE 的結果顯示，Ala-TS-lip所含Sal B在肝組織中的AUC分別是脾、肺和腎組織的1.19、1.39、63.67 倍，而TSN 在肝組織中的AUC 分別是脾、肺和腎組織的4.64、0.36、14.12倍，均表現出了較好的肝組織TE。

綜上，TSN-Sal B復方脂質體經過甘草次酸衍生物配體18-GA-Ala 的修飾后，Sal B 和TSN 對肝組織的靶向增強，配體18-GA-Ala 表現出一定的肝靶向作用。

4 討論

肝實質細胞表面存在大量的特異性甘草次酸結合位點，故可以通過修飾脂質體上的介導分子來實現對特定組織的主動靶向作用。例如，張其勝等[18]將甘草次酸標記在經6-甘露糖修飾的白蛋白上，可選擇性地靶向分布到HSC 中；吳超等[19]發現甘草次酸修飾的脂質體在肝組織中的分布要高于藥物溶液組。本研究也驗證了經18-GA-Ala 修飾的脂質體可以提高Sal B和TSN在肝臟中的峰濃度，組織分布也表明，修飾后的脂質體可以促進藥物在肝臟中的分布。這說明甘草次酸衍生物也可成為靶向肝的良好配體，結構修飾后滿足實驗的需要。此外，甘草次酸不僅可實現肝細胞靶向性，還可作為抑制膠原合成、減少肝纖維化的有效藥物，與其他抗肝纖維化藥物產生協同作用[20]。

此外，肝實質細胞膜上還存在視黃醇蛋白、無唾液酸糖蛋白等受體，非實質細胞存在甘露糖、低密度脂蛋白等受體。通過對脂質體進行一定的結構修飾，如連接甘草次酸及其衍生物等配體，可發揮配體-受體間的特異性結合作用，促進包載藥物的脂質體主動靶向肝組織，提高生物利用度。這種利用配體-受體特異性結合的功能可為主動靶向其他組織治療相關疾病的藥物遞送研究提供參考。