知母標準湯劑的質量評價方法及指標成分的量值傳遞規律探索

李鵬躍，趙金榮，2，薛曉霞，代云桃*

1.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；

2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

湯劑亦稱湯液，是指將飲片加水煎煮，去渣取汁而得到的液體制劑。湯劑是我國應用最早的劑型之一，也是目前中醫臨床應用最廣泛的劑型。中藥飲片標準湯劑是以中醫理論為指導、臨床應用為基礎，參考現代提取方法，經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑[1]。

知母入藥始載于《神農本草經》[2]，為百合科知母屬植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬干；或除去外皮，曬干[3]。知母用藥歷史悠久，是中藥復方的重要組成藥味之一，具有清熱瀉火、滋陰潤燥之效，臨床上用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內熱消渴、腸燥便秘[3]。2018年4月國家中醫藥管理局同國家藥品監督管理局制定并頒布《古代經典名方目錄（第一批）》，其中包含知母的經典名方有7 首，包括桂枝芍藥知母湯、清金化痰湯、玉女煎、清骨散、達原飲、升陷湯、二冬湯[4]。建立知母標準湯劑質量評價方法對這些經典名方中知母藥味的質量控制具有重要參考價值。

現代研究表明，知母所含活性成分主要為皂苷類、黃酮類等，其中皂苷類成分根據其苷元結構的不同可分為螺甾皂苷、呋甾皂苷兩大類；黃酮類的主要成分為氧雜蒽酮，如芒果苷（MGF）、異芒果苷、新芒果苷等[5-6]。已有文獻報道知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）具有抗氧化、抗炎、降糖、抗抑郁等作用[7-10]，MGF具有降血糖、抗炎、抗腫瘤、抑菌等作用[11]。知母藥材中兩者含量均較高，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定，TB-Ⅱ質量分數不低于3%，MGF 質量分數不低于0.7%[3]，因此適合作為知母標準湯劑質量評價的指標成分。知母的產地主要為我國河北、山西、山東、陜西、甘肅、內蒙古、遼寧、吉林和黑龍江等地，朝鮮也有分布。知母產地最早記載于漢代《神農本草經》：“知母，味苦寒……生川谷。”[2]《名醫別錄》記載：“知母生河內川谷，二月八月采根暴干?！盵12]《本草圖經》記載：“知母生河內川谷，今瀕河諸郡（今甘肅蘭州）及解州（今山西永濟）、滁州（今安徽滁州）亦有之?！盵13]《本草蒙筌》記載：“多生徐解二州。”[14]《藥物出產辨》記載：“知母產直隸東陵西陵最為出名。”[15]綜上所述，河北易縣所產西陵知母最為道地。西陵知母在河北易縣及其周邊有大量栽培，野生資源較少。野生品主要分布在河北易縣、淶水、淶源、滿城等地的陽坡，栽培品在河北省保定市大部分地區均有引種，尤以疏松的腐殖質壤土栽培為宜?！吨兴幹尽酚涊d：“知母主產于河北易縣、懷來、房山、淶源、承德、張家口，此外山西盂縣、長治，河南濟源、林縣、內蒙古、甘肅，陜西及東北各省均產?！盵16]本研究以知母為研究對象，購買來自河北、山西、內蒙古3 個產地的10 批知母飲片，以標準化工藝制備知母標準湯劑[1]，參考《中國藥典》2020 年版中知母的含量測定方法，建立知母標準湯劑的含量測定方法，計算10 批知母湯劑中的指標成分（MGF、TB-Ⅱ）的含量及轉移率范圍，進而分析飲片與標準湯劑間指標成分的量值傳遞規律，為制定水煎液及其產品的質量控制方法提供參考。

1 材料

ACQUITY UPLC H-class 型超高效液相系統[配備光電二極管陣列（PDA）檢測器，美國Waters 公司]；1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；2000 型蒸發光散射檢測器[ELSD，美國奧泰科技（中國）有限公司]；HC-3018 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；XSR105/A 型十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；101 型電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司）。

10 批知母飲片來源信息見表1，經中國中醫科學院中藥研究所代云桃研究員鑒定，飲片基原均為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖。對照品MGF（批號：111839-201706，純度：94.5%）、TB-Ⅱ（批號：111607-201704，純度：94.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

表1 知母來源信息

2 方法與結果

2.1 知母標準湯劑的制備

取知母飲片100 g，置于圓底燒瓶中，加7 倍量水，放置浸泡30 min，加熱沸騰后，文火保持微沸30 min，趁熱濾過，藥渣再加6 倍量水，加熱沸騰后，文火保持微沸30 min，趁熱濾過，合并2 次濾液，并減壓濃縮至500 mL，即得。

2.2 標準湯劑供試品溶液的制備

MGF 含量測定供試品溶液：取所得知母標準湯劑，用甲醇稀釋20 倍，12 000 r·min–1離 心5 min（離心半徑為5.79 cm），取上清液，即得；TB-Ⅱ含量測定供試品溶液：取所得知母標準湯劑，用甲醇稀釋10 倍，12 000 r·min–1離心5 min（離心半徑為5.79 cm），取上清液，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取MGF 對照品適量，加稀乙醇制成1.6 mg·mL–1MGF 對照品母液。精密稱取TB-Ⅱ對照品適量，用二甲基亞砜制成1.6 mg·mL–1TB-Ⅱ的對照品母液。

2.4 指標成分色譜分析方法

2.4.1 MGF色譜分析方法

2.4.1.1 色譜條件 HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，10%～13%B；3～6 min，13%～14%B；6～7 min，14%～90%B），柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL·min–1，檢測波長為258 nm，進樣量為1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 知母標準湯劑的MGF含量測定的UPLC-PDA圖

2.4.1.2 方法學考察 線性關系考察：取2.3 項下對照品溶液，加甲醇稀釋，得MGF質量濃度分別為0.320、0.160、0.128、0.080、0.064、0.032、0.016 g·L–1的溶液，按2.4.1.1 項下色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得MGF 線性回歸方程為Y=9 744.9X–13.769（r=0.999 6），線性范圍為0.016～0.320 g·L–1。

精密度考察：取ZM09 知母標準湯劑適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1.1 項下色譜條件連續進樣6 次，計算MGF 峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.6%，表明儀器精密度良好。

重復性考察：取知母標準湯劑ZM09共6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1.1 項下色譜條件測定，計算MGF 平均質量分數為1.02%，RSD為4.0%，表明該方法重復性良好。

穩定性考察：取ZM09 知母標準湯劑適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、1、4、6、8、12、24 h 按2.4.1.1 項下色譜條件測定，計算MGF 峰面積的RSD 為1.5%，表明知母標準湯劑供試液在24 h內穩定。

加樣回收率試驗：取已知MGF含量的ZM09知母標準湯劑200 μL，按1∶1添加對照品，按2.2項下方法分別平行制備6份供試品溶液，按2.4.1.1項下色譜條件測定，計算MGF的平均加樣回收率為101.68%，RSD為1.1%，說明該方法準確可靠（表2）。

表2 知母標準湯劑中MGF含量測定的加樣回收率試驗

2.4.2 TB-Ⅱ色譜分析方法

2.4.2.1 色譜條件 同《中國藥典》2020 年版方法[3]，采用Thermo Aclaim? RD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（25∶75）為流動相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min–1，進樣量為10 μL，利用ELSD 檢測，漂移管溫度為104 ℃，載氣流速為2.8 L·min–1。理論板數按TB-Ⅱ峰計算應不低于10 000。色譜圖見圖2。

圖2 知母標準湯劑的TB-Ⅱ含量測定的UPLC-ELSD圖

2.4.2.2 線性關系考察 取2.3 項下對照品溶液，加甲醇稀釋，得TB-Ⅱ質量濃度分別為1.060、0.530、0.265、0.106、0.053 g·L–1的溶液，按2.4.2.1 項下色譜條件測定，以質量濃度的自然對數為橫坐標（X），峰面積自然對數為縱坐標（Y），得TB-Ⅱ的線性回歸方程為Y=0.945 3X+7.867 7（r=0.997 0），線性范圍為0.053～1.060 g·L–1。

2.5 知母飲片及標準湯劑指標成分的含量測定

知母飲片中MGF、TB-Ⅱ的含量測定方法依照《中國藥典》2020年版，標準湯劑中MGF、TB-Ⅱ的含量測定方法依照2.4 項下分析方法測定。樣品分析結果顯示，10批知母飲片和標準湯劑中MGF的質量分數分別為1.66%～2.04%和0.88%～1.12%，平均值分別為1.89%和0.98%，均在均值的±30%范圍內（分別為1.33%～2.46%和0.69%～1.27%）。10 批知母飲片和標準湯劑中TB-Ⅱ的質量分數分別為3.28%～6.81%和0.88%～2.53%，平均值分別4.73%和1.71%，其中3 批知母飲片（ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的質量分數不在均值的±30%范圍內（3.31%～6.15%），表明該研究所用不同產地知母飲片中TB-Ⅱ含量波動范圍較大，其中山西萬榮縣知母飲片TB-Ⅱ含量最高；4 批知母湯劑（ZM04、ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的質量分數不在均值的±30%范圍內（1.20%～2.22%），該結果可能是由研究所用不同產地知母飲片中TB-Ⅱ含量的波動大所致。

2.6 知母標準湯劑其他質量屬性測定

按公式（1）計算指標成分的轉移率。

式中W表示1 g 飲片經標準湯劑提取出的MGF或TB-Ⅱ的質量，M表示1 g 飲片按《中國藥典》2020 年版方法測定的MGF 或TB-Ⅱ的質量（表3）。結果顯示，10 批知母飲片到湯劑MGF、TB-Ⅱ的轉移率分別為45.83%～57.27% 和26.94%～43.49%，平均值分別為51.87%和35.72%，均在其均值的±30%范圍內（36.31%～67.43%、25.01%～46.44%）。

表3 知母含量測定與湯劑特征參數結果

分別取2.1 項下的標準湯劑50 mL，90 ℃干燥至恒重，稱取浸膏的質量，根據公式（2）計算標準湯劑的出膏率。

結果顯示，10批知母標準湯劑的出膏率為29.0%～45.0%，平均值為37.2%（表3），均在其均值的±30%范圍內（26.0%～48.4%）。

將pH 計校正，吸取2.1 項下的標準湯劑，在25 ℃條件下測定其pH，平行測定3 次，取平均值（表3）。結果顯示，10 批知母標準湯劑的pH 為4.96～5.40，平均值為5.17，均在其均值的±30%范圍內（3.62～6.73）。

3 討論

本研究于《中國藥典》2020 年版知母藥材含量測定方法的基礎上建立知母標準湯劑中TB-Ⅱ的HPLC-ELSD 含量測定方法，以及知母標準湯劑中MGF 的HPLC-PDA 含量測定方法。優化了MGF 分析的流動相和洗脫條件，方法學考察結果顯示所建立的MGF含量測定方法準確、重復性好，能用于知母準湯劑中MGF的含量測定。

轉移率反映了標準湯劑制備工藝對指標成分的影響，也反映了制備工藝的穩定性。而標準湯劑中指標成分的含量與所用飲片中指標成分的含量密切相關。10 批知母湯劑中的指標成分的含量及轉移率結果顯示，知母飲片、標準湯劑中分別有3、4 批樣品的TB-Ⅱ不在其均值的±30%范圍內，該結果表明本研究所用不同產地知母飲片中TB-Ⅱ含量波動范圍較大[17]。但是TB-Ⅱ、MGF 從10 批知母飲片到標準湯劑的轉移率范圍在均值的±30%范圍內，提示TB-Ⅱ、MGF 在知母標準湯劑制備過程中轉移情況穩定，表明本研究所用的標準湯劑制備工藝參數穩定。上述結果提示不同產地引起的知母飲片中TB-Ⅱ的含量波動會傳遞到知母標準湯劑中[17]。因此，在后續知母標準湯劑及所有源于知母水煎液的經典名方制劑研究中，建議對知母飲片中的指標成分（MGF、TB-Ⅱ）含量范圍進行限定或者進行混批操作，以縮小原料引起的知母標準湯劑及經典名方制劑質量波動。

本課題組前期對15 批二冬湯基準樣品中知母藥味的指標成分（MGF、TB-Ⅱ）質量分數及轉移率進行了分析[18]，二冬湯中包括了天冬、麥冬、天花粉、知母、人參、甘草、荷葉、黃芩8 個藥味。與知母標準湯劑相比，二冬湯基準樣品中MGF轉移率的均值降低，而TB-Ⅱ轉移率的均值升高，知母飲片在制備為標準湯劑及二冬湯基準樣品的過程中MGF、TB-Ⅱ 2 個指標成分的轉移率變化趨勢不同，推斷導致此結果的原因可能包括二冬湯基準樣品其余藥味成分對知母藥味中成分溶出的影響。除了知母外，二冬湯中天冬、麥冬、天花粉、知母、人參、甘草5 個藥味均含有皂苷類成分，根據相似相溶原理，可能這些藥味中皂苷類成分促進了知母飲片中皂苷類成分的溶出，從而導致TB-Ⅱ轉移率高于知母標準湯劑。因此，在含有同一藥味的不同經典名方基準樣品研究中，不同復方中同一藥味轉移率可能不相同，造成這一現象的原因可能來自復方中其余藥味飲片成分的影響。