淫羊藿誘導ADSCs成骨分化作用于骨質疏松癥防治的研究進展

劉海全，吳梅劍宗，蒙祖玉

1.廣州中醫藥大學惠州醫院骨科（廣東惠州 516000）

2.惠州市中醫醫院骨科（廣東惠州 516000）

3.暨南大學中醫學院（廣州 510000）

骨質疏松癥（osteoporosis,OP）嚴重影響患者的健康水平，該病是一種全身性骨病，以骨量低下、骨微結構損壞、骨脆性增加為主要病理變化。OP主要致病因素包括成骨潛能減弱和破骨潛能增強，原發性骨重塑失衡最終導致骨破壞[1]。目前，針對OP防治的研究更傾向于阻止骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化，增強其向成骨細胞分化的能力[2]。因此，脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）成骨分化是治療OP的潛在策略。中醫將OP歸屬于“骨痿”范疇，其主要病機是腎虛精虧，辨證論治以補腎為主。淫羊藿具有補腎陽、強筋骨之功，含有多種化學成分及微量元素，如淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗骨質疏松、抗腫瘤、抗抑郁等作用，臨床應用廣泛[3-4]。前期研究證實，中藥淫羊藿可促進骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、ADSCs的成骨分化[5]，其作用機制可能與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）、Ajuba、Hippo信號通路相關。現就淫羊藿防治OP與Ajuba/Hippo/PPARγ信號軸的相關性，以及可能存在的作用機制作如下綜述，旨在初步闡明淫羊藿防治OP相關分子的作用機制。

1 淫羊藿治療骨質疏松癥的概述

1.1 中醫關于骨質疏松癥的概述

中醫學中無“OP”這一病名，歷代中醫文獻記載中的“骨痿”“骨枯”等證的描述與現代醫學OP的臨床表現及發病機制頗為相似。《素問·痿論》曰：“腎主身之骨髓，腎氣熱，則腰脊不舉，腎枯而髓減，發為骨痿”。腎藏精，主骨生髓，精化髓，骨賴髓以充養，腎精充足則髓充而骨堅韌；腎精不足，骨髓空虛，骨失其養而脆弱無力，不耐久立和勞作。目前中醫將其歸屬于骨痿范疇，其主要病機是腎虛精虧，辨證論治以補腎為主。

1.2 淫羊藿概述

淫羊藿性味辛甘性溫，歸肝、腎經；功善補腎陽、強筋骨、祛風濕，用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣等癥。該藥功效古籍中亦有記載，《本草綱目》中稱其有“益精氣，堅筋骨，補腰膝，強心力”之功效；《日華子本草》載“治一切冷風勞氣，補腰膝，強心力，丈夫絕陽不起，女子絕陰無子，筋骨攣急，四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。淫羊藿作為防治OP最常用的中藥之一，其安全性和有效性已被證實[6-7]。研究表明，淫羊藿具有抗OP、調節免疫、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤等作用，淫羊藿植物、酮類物質及活性單體多次被證明具有類雌激素樣作用[8-9]。淫羊藿還參與調節大量與細胞因子、腫瘤、免疫、自噬、凋亡、神經傳導、雌激素相關信號通路及生物過程[10-11]。

1.3 淫羊藿促進骨細胞成骨分化

淫羊藿有效成分淫羊藿苷可促進成骨細胞增殖與分化、礦化結節形成與骨形成。同時，還能降低破骨細胞中鈣離子濃度，減少細胞內超氧陰離子自由基，導致吸收陷窩面積減小，抑制破骨細胞的骨吸收。淫羊藿苷作用機制包括：抑制膜鐵轉運蛋白1（ferroportin 1,FPN1）表達，調節鐵死亡通路，促進成骨細胞增殖及分化[12]；保護高糖誘導的成骨細胞，促進其增殖，作用機制可能與調控成骨細胞ISR1/AKT/Runx2信號通路有關[13]；促進負調控因子Gα13的表達，從而抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1信號通路以抑制破骨細胞形成[14]；上調Nrf2/HO-1信號傳導通路，促進破骨細胞氧化應激改變，增加破骨細胞內ROS水平，提高破骨細胞內亞鐵離子水平，下調鐵代謝相關的GPX4基因表達，進而調控破骨細胞內鐵代謝水平，增加其氧化應激損傷，從而抑制破骨細胞形成和骨吸收[15]；增加去卵巢骨質疏松大鼠骨密度和骨礦含量，改善血清BGP、ALP、Ca水平，抑制成骨細胞凋亡；其機制可能與上調骨組織OPG mRNA表達、下調RANKL mRNA、RANK mRNA表達有關[16]。

1.4 淫羊藿促進脂肪間充質干細胞成骨分化

淫羊藿苷可直接抑制破骨細胞，促進成骨細胞增殖，改善骨組織微結構。多項研究表明，濃度為10-7mol/L的淫羊藿苷具有促進雄性小鼠ADSCs成骨分化的作用[17-18]。此外，淫羊藿可促進BMSCs成骨分化，抑制其向脂肪分化[19-20]。相較于BMSCs，ADSCs在來源、取材方法以及成果分化和繁殖速度等方面有更多優勢[21-22]。因此，淫羊藿調控ADSCs成骨分化的研究和應用價值更大。

研究發現，淫羊藿可促進ADSCs成骨分化，抑制成脂分化[5]。進一步通過RNA測序分析篩選出Ajuba基因，發現其在淫羊藿組誘導后表達明顯降低。同時結合基因集富集分析發現Ajuba與干細胞相關，結合測序結果中差異基因的通路分析，結果發現調節Hippo信號通路的差異基因占有較大比例；同時通過熒光素酶活性檢測發現，Ajuba高表達，Hippo信號通路活性受到抑制。

2 脂肪間充質干細胞對骨細胞的成骨分化作用

目前公認的OP發病機制是成骨細胞和破骨細胞在塑造過程中失衡，成骨細胞數量和活性降低，破骨細胞數量及活性增加，導致骨吸收大于骨形成，造成骨質疏松。此前研究多集中在BMSCs成骨分化方面，但是BMSCs體外培養對取材要求高，需從骨髓腔中取材，取材困難，且其來源少，更重要的是細胞增殖速度較慢，限制了其廣泛應用。ADSCs是從脂肪組織中分離得到的一種多向分化的干細胞，可分泌包括血管內皮細胞生長因子、腦源性神經營養因子及肝細胞生長因子等多種細胞因子[23]。ADSCs具有體內儲存量大、可反復取材、容易獲取及增殖能力較強的特點，且具有免疫原性較低、成瘤性較低、移植排斥反應較少的特點，是理想的種子細胞來源[2,24]。既往研究證實，應用SDF-1、NELL-1單獨轉染，或兩者共轉染ADSCs，特別是兩種基因共同轉染，可顯著增強ADSCs的體外成骨效果[25]；合適的應力刺激可以提高ADSCs內成骨相關mRNA表達，并促進其向成骨細胞分化[26-27]。卓麗丹等研究證實，BMSCs和ADSCs生物學性狀穩定，均具有成骨分化潛能；細胞增殖實驗顯示P3代ADSCs的增殖能力強于BMSCs[28]。上述研究表明ADSCs在受到物理、化學等刺激時可通過不同機制加強ADSCs成骨分化傾向。

3 Ajuba蛋白調控Hippo通路參與脂肪間充質干細胞成骨分化

3.1 PPARγ與骨質疏松癥發病機制、干細胞成脂分化關系

PPARγ主要在脂肪組織中表達，調控脂肪細胞的分化，其中PPARγ2較特異地在脂肪組織中表達，被誘導后啟動脂肪細胞基因轉錄，是促進脂肪細胞分化最關鍵的調控因子。研究發現活化PPARγ可促進ADSCs向脂肪細胞分化，抑制成骨分化[29]。Sirtuin 蛋白家族是一類高度保守的、NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶和 ADP 核糖基轉移酶，在卡路里限制、細胞壽命調控和多種糖脂代謝中起重要作用。其中Sirt1為Sirtuin 蛋白家族重要成員之一，調控多種細胞轉錄因子，具有平衡干細胞的靜息與增殖、維持干細胞自我更新功能、緩解年齡相關性成體干細胞功能下降和抑制成體干細胞分化紊亂的作用。研究發現Sirt1是PPARγ2的上游調控因子，可使PPARγ2乙酰化，從而抑制其活性[30]。應用淫羊藿含藥血清干預去勢大鼠BMSCs，能夠有效上調Sirt1表達水平，抑制PPARγ表達，促進BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化的作用，從而發揮淫羊藿對OP的防治作用[31-32]。

3.2 Hippo通路與骨質疏松癥發病機制

進化上高度保守的Hippo信號通路是細胞正常生命活動的重要調節器，其在調控器官發育、腫瘤發生發展和組織穩態方面具有重要作用。近年來，Hippo信號通路調節骨代謝的潛在生物學機制成為該領域又一研究熱點。哺乳動物Yes相關蛋白（yes-associated protein,YAP）/攜帶PDZ結合基序的轉錄輔助激活物（transcriptional coactivator,TAZ）為Hippo信號通路核心組件，在其上下游多種轉錄因子的介導下，Hippo信號通路調控成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞等細胞的生理活動。研究發現，Hippo途徑通過激酶級聯控制YAP/TAZ轉錄輔活化因子的活性，這一途徑在細胞分化和組織生長中起著關鍵作用[33]。YAP和TAZ是兩種促進細胞增殖、干細胞維持和組織穩態的同源轉錄輔激活因子。Hippo通路參與成骨分化，TAZ能與Runx2結合入核，促進成骨相關基因表達，從而促進成骨分化[34]。胡佳安等研究發現，ADSCs體外成骨分化過程中TAZ表達上調，而在成脂分化中其表達降低[35]；TAZ激動劑TM-25659可以促進ADSCs中TAZ的表達，并增強ADSCs體內成骨及骨生成能力；當TAZ通過WW結構域與PPARγ的PPXY模體結合后，抑制PPARγ活性，進而抑制ADSCs向脂肪細胞分化，促進其向成骨細胞分化[36]。同時，YAP也有類似的作用。磷酸化的YAP可在細胞核內與Runx2結合，促進BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化，且其成骨分化程度與細胞骨架密度呈正相關[37]。

3.3 Ajuba與PPARγ、Hippo信號通路相關性

Ajuba分子屬于Zyxin/Ajuba家族，作為支架蛋白或銜接蛋白參與細胞黏附、增殖、遷移等功能，其在調節器官發育過程中的細胞增殖反應、修復受損組織和早期癌癥發展中發揮關鍵作用，并在細胞增殖過程中限制Hippo信號通路活性[38]。YAP1是Hippo信號通路下游的主要效應因子。在哺乳動物和果蠅細胞中，Ajuba可以通過抑制細胞內的Hippo激酶復合物，使YAP1去磷酸化，抑制Hippo信號通路，從而促進細胞增殖[39]。Ajuba是細胞成脂分化的重要調節劑，是一種新型的PPARγ相互作用蛋白。Ajuba與LPL啟動子的結合在很大程度上取決于PPARγ的存在，進而可以增強Ajuba和PPARγ的DNA結合，Ajuba通過其preLIM區域直接結合PPARγ的DNA結合結構域，需要Ajuba才能最大程度地激活PPARγ，Ajuba和PPARγ協同作用激活靶基因的表達。此外，Ajuba通過與C/EBPβ的相互作用促進C/EBPβ與PPARγ和C/EBPα啟動子結合促進脂肪生成[40]。Ajuba可以免疫沉淀內源性p300和CBP，是PPARγ有效募集p300/CBP所必需的目標染色質，可通過其LIM域將p300/CBP募集到PPARγ，表明PPARγ與Ajuba成員選擇性相互作用[41]。

根據上述研究可以初步推斷，在OP發病機制中，PPARγ、Hippo通路、Ajuba三者之間存在著密切的關聯性；結合前期實驗研究，中藥淫羊藿作用于ADSCs防治OP的作用機制，可能與其通過Ajuba/Hippo/PPARγ通路誘導ADSCs成骨分化有關。

4 結語

間充質干細胞成骨分化減少、成脂分化增加導致的骨平衡失穩是OP發生的重要因素之一，通過促進ADSCs成骨分化、增加骨形成可以作為OP的潛在治療方案[42-43]。此外，還有研究表明通過移植ADSCs可以改善去勢大鼠的骨量流失[44]；通過淫羊藿苷干預可以提高復合支架共培養ADSCs的存活率并促進其成骨分化[45]。然而，ADSCs具有多種分化潛能，其中的調控機制尚不十分明確。結合前期工作及目前研究情況，故推測淫羊藿誘導ADSCs成骨分化，抑制其成脂分化，可能通過調控Ajuba/Hippo/PPARγ信號軸發揮相關作用。Ajuba/Hippo/PPARγ信號軸在淫羊藿刺激誘導ADSCs成骨及成脂的分化過程中起著重要的作用，探明其作用相關分子機制將為淫羊藿干預ADSCs的臨床干細胞治療提供實驗數據，明確淫羊藿促進ADSCs成骨分化的分子機制，為淫羊藿防治OP的臨床應用提供實驗依據。同時，臨床應用ADSCs治療OP仍存在許多問題，如治療途徑、移植治療后細胞遷移及歸巢等。下一步研究中，將致力于藥物干預后干細胞臨床治療的相關研究，以獲得更為有效的OP診療方法。