U266多發性骨髓瘤細胞株中CD138陰性細胞的分離和培養

張　霞，胡大春

(云南省昆明市第一人民醫院檢驗科　650011)

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U266多發性骨髓瘤細胞株中CD138陰性細胞的分離和培養

張霞，胡大春

(云南省昆明市第一人民醫院檢驗科650011)

摘要:目的從U266多發性骨髓瘤細胞株中分離CD138陰性細胞,對其進行培養，觀察分離到的CD138陰性細胞的生長特性。方法用免疫磁珠法分離U266多發性骨髓瘤細胞株中的CD138陰性細胞，用干細胞培養基進行培養。結果從U266多發性骨髓瘤細胞株中分離CD138陰性細胞在干細胞培養基內呈球體生長。結論CD138陰性細胞具有干細胞生長的相關特征。

關鍵詞:多發性骨髓瘤；CD138；腫瘤干細胞

多發性骨髓瘤(MM)是一種主要發生于中老年人群的惡性漿細胞腫瘤，在歐美國家血液腫瘤中的占比達10%。近年來，隨著我國進入老齡化社會，MM的發病率已呈明顯上升趨勢[1]。目前MM治療措施已有大的進步。可同時針對MM細胞本身和其所處微環境進行大劑量化療治療，這些大劑量化療聯合應用自體造血干細胞移植和(或)異體造血干細胞移植，使得部分患者可獲得完全緩解(CR)，但這些患者多數會出現復發。其復發的主要原因之一是存在于微量殘留病灶(MRD)，即在患者的體內可能存在極少量能夠誘導腫瘤復發的“種子細胞”或者說“腫瘤干細胞”[2]。2012年Kawano等[3]發現，復發、進展中的MM患者與未治療的MM患者比較，CD138陰性B細胞比例有著顯著增加。通過實驗研究也發現CD138陰性B細胞增多和MM患者的不良預后、細胞表型的更幼稚，以及對雷利度胺和治療表現為低敏感，這些特征都證明CD138陰性B細胞可能是MM 腫瘤干細胞。

1材料與方法

1.1材料人MM細胞U266購自中國科學院昆明動物研究所。

1.2儀器與試劑改良型RPMI-1640培養基購自Gibco公司；RNAiso Plus購自TaKaRa公司；CDNA逆轉錄試劑盒購自廣州復能基因有限公司；LONZA X-VIVO無血清培養基購自LONZA公司；rhIL-3、SCF和LIF購自PeproTech公司；PE-CD138抗體購自貝克曼公司；MicroBead CD138抗體購自德國美天旎公司。

1.3方法U266MM細胞株中CD138陰性細胞的分選和培養。首先對U266細胞進行預處理，使用MicroBead CD138抗體和U266細胞進行孵育，然后用分離系統分離獲取CD138陰性細胞，最后用干細胞培養基和干細胞培養6孔板進行培養。5 d進行1次傳代，2次傳代后在進行1次免疫磁珠分離，培養5 d后觀察細胞生長的特征、流式細胞CD138陰性細胞純度的鑒定及傳代培養。干細胞培養基配制：由無血清LONZA X-VIVO培養基按比例加入20 ng/mL人類重組白細胞介素3(rhIL-3)、50 ng/mL白血病抑制因子(LIF)、20 ng/mL干細胞因子(SCF)。

2結果

2.1U266 MM細胞株中CD138陰性細胞分選與純度分析第1次磁珠法分選收集到CD138陰性細胞懸液，用PE-CD138熒光抗體染色，進行流式細胞技術純度分析，其中CD138陰性細胞數僅占41.4%。由于第1次分選到的細胞中CD138陰性細胞占比較低，不能滿足分析需求，因此對第1次分選收集到細胞進行培養后在進行第2次磁珠分選和第2次流式細胞技術純度分析。第2次磁珠分選后得到的CD138陰性細胞純度為71.6%，見圖1。

圖1　　第2次磁珠分選CD138陰性細胞結果

2.2CD138陰性細胞在干細胞培養液中的生長情況CD138陰性細胞在干細胞培養液中呈漂浮立體球狀生長，球體巨大，細胞之間結合緊密，其生長情況見圖2(低倍鏡)。

圖2　　　　　CD138陰性細胞在干細胞培養液中的生長情況(10×)

3討論

2004年Matsui 證實MM腫瘤樣本和細胞系中存在克隆性極強的CD19+CD138-腫瘤干細胞[4],而源自MM細胞系和臨床患者骨髓標本中的CD138-CD34-細胞也被認為是MM干細胞[5]。而腫瘤干細胞是腫瘤細胞增殖、化療耐藥、轉移及復發的重要因素，更是治療的一個關鍵靶點[6]。

目前腫瘤干細胞研究的首要問題就是分離與鑒定。目前，腫瘤干細胞常用的分離方法有無血清懸浮細胞培養法[7]、側群細胞法[8]、流式細胞分選法[9]和免疫磁珠分選法[10]。無血清懸浮培養法是人為地制造一富集腫瘤干細胞的培養環境，與腫瘤干細胞實際生長的體內微環境不盡相同，目前有爭議；側群細胞法熒光染料本身具有細胞毒性，被標記分選出的細胞活性有可能受到影響，從而影響實驗效果和準確性；流式細胞分選法應用廣泛，但耗時較長，分選的細胞活性可能受損影響功能；免疫磁珠法免疫磁珠特異性高，適合分選單個陽性表達的細胞，且分選的細胞純度及細胞活力均較高，并且可以短時間內反復大量獲取所需要的干細胞。本試驗經過2次磁珠分選后CD138陰性細胞地純度才達到71.6%。因為分選的CD138陰性細胞屬非陽性細胞，在分選過程中，附著在LD柱上的CD138陽性細胞可因多種因素進入到CD138陰性細胞中，導致CD138陰性細胞的純度下降：(1)細胞因素，離心的細胞未用胰酶消化，細胞成團，細胞團中心的細胞與免疫磁珠上的CD138抗體未充分接觸；細胞計數誤差大遠低于實際細胞數，導致免疫磁珠CD138抗體用量不足；(2)免疫磁珠CD138因素，主要見于免疫磁珠的抗體效價下降，導致免疫磁珠CD138用量不足；(3)操作者因素，一次性在柱上加入大于說明書規定的buffer用量，將CD138陽性細胞帶入CD138陰性細胞中；(4)細胞自身因素，細胞活性下降，CD138陰性細胞含量很少等原因。因此欲獲取純度較高的CD138陰性細胞，一般都要經過2次或多次分選才可能獲得較高純度。

在對CD138陰性細胞培養中，選擇2種刺激造血干細胞的細胞因子，rhIL-3和SCF刺激其生長。同時添加LIF抑制CD138陰性細胞向下分化，維持其多能性。另外選擇含有IMDM、胰島素、轉鐵蛋白和人血清清蛋白無血清淋巴細胞培養基作為基礎培養液添加生長因子聯合配成干細胞培養基。

用干細胞培養液對CD138陰性細胞培養5～7 d培養形成漂浮狀的球體細胞，通常干細胞生長的球體形狀可作為干細胞鑒定的一個依據，但是該方法仍有其自身的不足[11]：腫瘤球仍然是個混合細胞群體，它僅代表一小部分的腫瘤起源細胞，其潛在的異質性通過腫瘤球篩選可能被丟失。另外，這些腫瘤球傳代要進行大量擴增，而在擴增的過程中可能誘導細胞生物學和基因表達的改變，需要強有力的證據來鑒定細胞表面抗原。因此可選擇少量干細胞胚胎標記物來對腫瘤球進行鑒定，同時也可用TSC基于SP細胞特性、腫瘤細胞體外形成克隆能力、動物致瘤性試驗等來對腫瘤球進行鑒定。目前已有資料表明MM中CD138陰性細胞表達胚胎干細胞標志SOX2[12]。本試驗由于經費非常緊張，未進行相關的試驗進行CD138陰性球體細胞的驗證，為本試驗的一個缺陷。

參考文獻

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.041

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1999-03

(收稿日期：2016-01-28修回日期：2016-03-29)