miR-663b對IL-1β誘導的髓核細胞炎癥反應和凋亡的影響及其機制

李亞雄 馬學曉 常勝 魏嘉豪 劉勇

(青島大學附屬醫院脊柱外科,山東 青島 266035)

椎間盤退變(IDD)是引起腰痛的主要原因[1]。炎癥反應是IDD發生的重要病理機制。IDD發生初期,髓核組織和纖維環發生局部炎癥,這種初級炎癥反應有利于組織細胞的自我修復,當炎癥的發展失去可控性,內源性細胞持續上調多種促炎因子,如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[2],這些因子被認為是激活巨噬細胞炎性小體的上游信號,可阻止巨噬細胞抗炎表型的極化[3]。上述過程導致基質金屬蛋白酶激活、生長因子表達下調以及膠原蛋白、多聚糖蛋白降解等一系列級聯反應,最終引起髓核細胞(NPCs)的炎癥和凋亡,加速椎間盤退變[4]。

IL-1受體1(IL1R1)在不同人類及小鼠細胞類型中表達豐度低,但具有較高親和性[5]。椎間盤退變期炎性微環境內以IL-1β為主的炎癥因子升高,IL-1β與IL1R1結合使其構象發生改變,產生強烈的促炎信號,加速NPCs的凋亡[6]。miRNA是長度約為20～25個核苷酸序列的內源性非編碼RNA,通過與靶基因結合,從而抑制靶基因的轉錄以及翻譯[7]。大多數miRNAs在各動物物種中作為關鍵生物通路和過程的調節器,在進化中起重要作用[8]。miR-663b在腫瘤及炎性相關疾病中研究比較多,有研究發現miR-663b主導的ceRNA調控網絡參與了脂多糖誘導的支氣管上皮炎癥改變的關鍵調控過程[9]。YU等[10]發現miR-663b在缺氧引起的心肌細胞初期炎癥調控中發揮著重要作用。本研究旨在探究miR-663b在減緩NPCs炎癥及凋亡中的作用,為IDD臨床治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集2021年9月—2022年5月于我院行椎間孔鏡下腰椎間盤切除術的24例IDD患者的椎間盤髓核組織標本。患者男11例,女13例;年齡25～59歲。排除標準:①哺乳期、妊娠期婦女;②合并急、慢性感染疾病者;③合并腫瘤者;④同時患有全身免疫性疾病或其他全身疾病者。

1.2 材料與試劑

F12/DMEM培養基、青/鏈霉素(1∶1)混合液、Ⅱ型膠原酶購自北京索萊寶有限公司,IL-1β購自美國MCE公司,RNeasyTM試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量擴增試劑盒購自南京諾唯贊有限公司,miRNA-663b mimic、mimic NC購自廣州銳博生物科技有限公司,293T細胞購自武漢普諾賽科技有限公司,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海雅酶有限公司,抗IL1R1一抗購自武漢Abclonal生物科技公司,HRP-山羊抗兔二抗購自上海愛必信有限公司,雙熒光素酶試劑盒、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自上海翌圣有限公司,TUNEL凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特有限公司。

1.3 細胞分離與培養

將手術取出的髓核組織立即用裝有組織保存液的冰盒轉移至試驗臺,PBS沖洗后用組織剪充分剪碎,按照髓核組織體積的3倍加入0.2%Ⅱ型膠原酶溶液37 ℃下在恒溫搖床中200 r/min消化4～6 h;采用70 μm細胞濾篩過濾細胞,以800 r/min離心5 min。棄上清液,加入5 mL含0.10 mL胎牛血清和0.01 mL的青霉素/鏈霉素(1∶1)的DMEM,重懸細胞后轉移至培養瓶中,并于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中繼續培養,每3 d換液1次,待NPCs傳至第2代,且細胞融合度約90%時用于后續實驗。

1.4 NPCs炎癥模型構建

將二代NPCs按每孔約5×104個細胞接種至6孔板中,鋪板培養24 h,在顯微鏡下觀察細胞的密度為80%左右時,按照0、5、10、20 μg/L濃度梯度加入IL-1β,繼續培養24 h后,通過RT-qPCR檢測不同IL-1β濃度下NPCs miR-663b的表達情況,以此選擇最佳處理濃度。隨后按最佳濃度處理NPCs 0、12、24、48 h,再次RT-qPCR檢測NPCs中miR-663b表達情況,從而選擇最佳處理時間。后續實驗均采用該NPCs炎癥模型進行。

1.5 NPCs分組及處理

將二代NPCs分為A、B、C、D組,分別按每孔約5×104個細胞接種至6孔板中。其中A組無任何處理,B組僅IL-1β誘導處理,C組IL-1β誘導+miR-663b mimic轉染,D組IL-1β誘導+miR-663b mimic NC轉染。

1.6 RT-qPCR法檢測A～D組NPCs miR-663b轉染效率及TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因的表達水平

使用RNeasyTM試劑盒分別提取A～D組二代NPCs的RNA,加入miR-663b逆轉錄引物(表1),按照miRNA以及mRNA逆轉錄試劑盒說明書中要求合成第一鏈cDNA,隨后分別按照miRNA以及mRNA熒光定量擴增試劑盒說明書的要求進行定量擴增,每組分別設置2個復孔。反應體系為:10 μL 的SYBR qPCR-Mix,0.4 μL的10 μmol/L前引物,0.4 μL的10 μmol/L后引物,1 μL模板,7.2 μL ddH2O。反應條件:95 ℃預變性30 s;然后95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,總共進行40次循環。miR-663b測定反應條件為:95 ℃預變性5 min;然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共進行40次循環。以U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內對照,以2-△△CT法計算基因的相對表達量,每組實驗重復3次,結果取均值。

表1 引物名稱及其序列

1.7 免疫印跡法檢測A～D組NPCs IL1R1的相對表達量

使用移液槍吸除A～D組二代NPCs的培養液,并用PBS輕柔沖洗3次。使用加有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,在碎冰上提取各處理組中NPCs蛋白[11]。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,每孔上樣20 μg蛋白,在含有150 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠的SDS-PAGE凝膠中電泳分離,先恒壓80 V電泳30 min,后調整電壓至120 V,電泳1 h。隨后在冰上將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,轉膜電流300 mA,時間2 h。用TBST漂洗3次PVDF膜后浸泡在脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結束后TBST漂洗3次,在4 ℃條件下與一抗孵育過夜。第2天回收一抗,加入辣根過氧化物酶標記過的二抗,室溫下孵育2 h。二抗孵育結束后,用TBST漂洗條帶3次,隨后滴加增強型特敏發光液進行顯影并拍照,以β-actin作為內參照,使用Image J軟件對條帶灰度值進行分析,IL1R1蛋白的相對表達量以IL1R1蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值計算。

1.8 CCK-8法檢測A～D組NPCs的增殖情況

將A～D組二代NPCs重懸并接種于96孔板中,密度為每孔約2×103個細胞,培養3 d后在相應孔中加入CCK-8試劑,繼續在37 ℃下孵育2.5 h,然后用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值,細胞活性用A值表示。

1.9 TUNEL染色法檢測A～D組NPCs凋亡情況

在4 ℃條件下將A～D組二代NPCs爬片浸入40 g/L的多聚甲醛溶液中,固定20 min,隨后PBS漂洗3次,使用0.2%的TritonX-100通透液浸泡5 min,PBS漂洗后加入適量凋亡檢測液放入濕盒中,37 ℃下孵育60 min。加入DAPI,室溫避光孵育8 min,PBS沖洗,加抗淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察,所有細胞核呈藍色,TUNEL染色陽性細胞(發生凋亡細胞)呈紅色,細胞凋亡情況用凋亡率表示(凋亡率=陽性細胞數/總細胞數)。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測及分析

在TargetScanHuman 7.1以及miRbase生物信息數據庫中篩選并且鑒定miR-663b的靶基因IL1R1[12],將IL1R1 3′端非翻譯區(UTR)基因片段插入pGL3 promoter載體,并參考IL1R1-野生型(wt)基因序列設計出IL1R1-突變型(mut)基因序列,同樣嵌入質粒中進行擴增,載體的構建由上海唯問生物科技有限公司完成。將購自普諾賽科技有限公司生長良好293T細胞按實驗需求分別轉染IL1R1-3′UTR-wt質粒+miR-663b mimic(E組)、IL1R1-3′UTR-wt質粒+miR-663b mimic NC(F組)、IL1R1-3′UTR-mut質粒+miR-663b mimic(G組)、IL1R1-3′UTR-mut質粒+miR-663b mi-mic NC(H組),轉染24 h后,收集細胞并裂解。使用雙熒光素酶報告檢測系統測定各組細胞熒光素酶活性,以海腎熒光素酶活性作為內參照。

1.11 統計學處理

2 結 果

2.1 NPCs炎癥模型構建

以0、5、10、20 μg/L的IL-1β處理后,各濃度下NPCs miR-663b相對表達量分別為1.00±0.01、0.63±0.05、0.32±0.68、0.36±0.61,組間比較有顯著差異(F=108.20,P<0.01),但10、20 μg/L濃度間無顯著差異(t=0.66,P>0.05),故確定10 μg/L為IL-1β最佳處理濃度。以IL-1β分別處理0、12、24、48 h后,不同處理時長NPCs miR-663b相對表達量分別為1.00±0.01、0.60±0.14、0.51±0.09、0.45±0.06,組間相比較有顯著差異(F=24.33,P<0.01),但是24 h較48 h無顯著差異(P>0.05),因此后續實驗選擇濃度10 μg/L的IL-1處理24 h構建NPCs炎癥模型。

2.2 miR-663b對A～D組NPCs中TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白和多聚糖蛋白基因表達影響

RT-qPCR結果顯示,miR-663b在4組中表達量比較差異有顯著性(F=141.30,P<0.01),C組與其他組比較miR-663b表達量均顯著性升高(t=9.41～22.93,P<0.01)。4組中炎癥因子基因表達比較均有顯著差異(F=20.27～125.70,P<0.01),與B、D組相比,C組TNF-α、IL-6、IL-1β基因相對表達量均明顯降低(t=3.17～32.51,P<0.01),A組亦降低(t=12.58～23.11,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。4組中Ⅱ型膠原蛋白及多聚糖蛋白基因表達差異有顯著性(F=14.96、30.02,P<0.01),與B、D組相比,C組Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因相對表達量均顯著升高(t=4.09～6.47,P<0.01),A組亦升高(t=3.27～3.96,P<0.01);B、D組相比則無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組miR-663b及炎癥因子、Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因的相對表達量比較

2.3 miR-663b對A～D組NPCs增殖及凋亡影響

CCK-8實驗結果顯示,A～D組二代NPCs培養3 d以后細胞活性值分別為1.66±0.17、1.16±0.13、1.45±0.02、1.10±0.01,4組細胞活性值比較差異有顯著性(F=16.97,P<0.05);與B、D組相比,C組細胞活性值均顯著升高(t=3.14、3.96,P<0.01),A組細胞活性值亦升高(t=3.18、3.21,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

TUNEL染色結果顯示,A～D組中二代NPCs凋亡率分別為0.96±0.05、4.20±0.03、1.10±0.01、4.06±0.05,4組NPCs凋亡率比較差異有顯著性(F=7 030.00,P<0.01)。與B、D組相比,C組細胞凋亡率均顯著降低(t=4.28、168.61,P<0.01),A組細胞凋亡率亦降低(t=3.68、100.04,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.4 miR-663b對A～D組NPCs中IL1R1基因及蛋白相對表達量的影響

RT-qPCR結果顯示,A～D組中IL1R1基因相對表達量分別為0.71±0.06、1.39±0.17、0.27±0.08、1.20±0.08,4組NPCs的IL1R1相對表達量比較差異有顯著性(F=62.21,P<0.01);與B、D組相比,C組IL1R1相對表達量顯著降低(t=6.48、12.84,P<0.01),A組IL1R1相對表達量顯著降低(t=5.18、10.07,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

免疫印跡法結果示,A～D組IL1R1蛋白相對表達量分別為0.26±0.01、0.45±0.02、0.30±0.03、0.51±0.02,4組比較差異有顯著性(F=82.11,P<0.01),與B、D組相比,C組IL1R1相對表達量顯著降低(t=6.39、9.69,P<0.01),A組IL1R1相對表達量亦顯著降低(t=12.34、19.51,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 4組NPCs免疫印跡檢測結果

2.5 E～H組NPCs的雙熒光素酶活性分析結果

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,E～H組的熒光酶活性值分別為28.90±1.25、45.66±2.43、41.54±1.23、45.54±1.26,4組比較差異具有顯著性(F=71.07,P<0.01)。E組與其他3組比較熒光酶活性值顯著降低(t=10.62～16.27,P<0.01),其余3組兩兩比較均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

髓核組織位于脊柱纖維環中心,上下終板之間,是維持椎間盤平衡以及穩態必不可少的組分[13]。NPCs表型發生改變、促炎遞質表達上調、活性細胞數量減少及細胞外基質含量下降被認為是IDD發生的主要病理特征,上述病理特征也導致了局部細胞微環境的改變,此類改變可以進展到IVD結構和功能的損害[14]。炎癥因子的升高是推動這一級聯事件的關鍵因素[15],因此抑制NPCs炎癥反應和凋亡是治療IDD的重要策略。

既往研究發現,退變椎間盤組織中IL-1β水平顯著升高參與了IDD的多個病理過程[16-17]。IL-1β引起基質生物學改變是IDD的特征[18-19]。IL1R1作為一種重要的免疫調節因子,在參與自身炎癥反應和調節免疫平衡方面發揮著重要作用,而IL1R1對于所有IL-1β介導的信號轉導事件都是必不可少的[20]。IL-1β與IL1R1結合在蛋白輔酶協助下誘導活性蛋白磷酸化,最終導致NF-κB激活,加劇細胞炎癥和凋亡。隨著分子芯片技術和微陣點分析技術的發展,越來越多證據表明miRNA在細胞分化、增殖和生存中發揮核心作用。近年來,miRNA被發現在介導細胞增殖和凋亡、炎癥反應以及細胞外基質降解等方面具有廣泛作用,眾多研究者將miRNA如何有效阻斷NPCs凋亡作為緩解IDD的研究重點[21]。JI等[22]從臨床數據集的miRNA芯片分析及體內外實驗中證實,miR-141通過與SIRT1/NF-κB通路相互作用,一定程度上促進IDD進展。DU等[23]研究發現抑制miR-133a-5p表達或增加FBXO6表達可能是治療IDD的有效策略。

本研究顯示,miR-663b在IL-1β構建的NPCs炎癥模型中表達下調,且呈劑量和時間依賴性。在證明了miR-663b在IL-1誘導的NPCs炎癥模型中表達下調后,本研究進一步探究了過表達miR-663b是否可以緩解NPCs炎癥和改善細胞基質成分的表達。實驗表明,過表達miR-663b的C組相比較于其他組,TNF-α、IL-6、IL-1β的表達被明顯抑制,而Ⅱ型膠原蛋白以及多聚糖蛋白基因的相對表達量明顯增高,這些結果均表明miR-663b在IL-1β刺激NPCs細胞的炎癥反應中起保護作用。本研究CCK8法及TUNEL染色結果顯示,C組相比較于其他組NPCs活性顯著上升,NPCs凋亡率顯著下降,上述結果表明miR-663b可以有效減緩NPCs炎癥反應,改善細胞基質分子的降解及NPCs的凋亡。另外,生物信息庫分析及雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-663b的下游靶點基因是IL1R1,說明了miR-663b通過抑制IL1R1表達,起到了減緩NPCs炎癥反應的作用。以上均表明miR-663b在IDD的進展中發揮重要作用,為探索IDD的病理機制提供了新的研究方向。

綜上所述,本研究發現miR-663b可以通過與IL1R1靶向結合下調IL1R1表達,從而減緩NPCs炎癥反應和凋亡進程,miR-663b及其抗炎機制或可為IDD研究提供更多理論基礎。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWELL27201)。所有試驗過程均遵照《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：李亞雄、馬學曉、劉勇參與了研究設計;李亞雄、常勝、魏嘉豪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。