ADSCs-CM對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞神經保護作用及其機制

肖歡歡 尹侃 肖雨 張崢 侯琳

(1 青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系,山東 青島 266071;2 青島微能生命科技集團有限公司; 3 濱州醫學院第二臨床醫學院)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的進行性神經退行性疾病,其主要原因是黑質中多巴胺能神經元的選擇性死亡,目前的治療方法主要是通過左旋多巴(一種多巴胺前體)增強正常運動所需的多巴胺能信號來改善癥狀[1],但是長期使用會使藥物敏感性降低。至今尚沒有可以減緩疾病進展或防止神經變性的有效方法,臨床迫切需要尋找治療PD新的靶點和生物標志物。

間充質干細胞(MSCs)條件培養基(CM)對PD有刺激神經發生和減少神經炎癥的作用,但是具體作用機制還不是很明確。以前針對MSCs的研究多是使用骨髓MSCs(BM-MSCs)[2],目前可從脂肪組織[3]、牙髓[4]、子宮內膜[5]、皮膚[6]、羊水[7]、胎盤[8]和臍帶血[9]中分離獲取。由于皮下脂肪組織豐富,易于獲取,并且具有最低限度的倫理考慮[10],因此,在各類的成體干細胞中,使用人脂肪間充質干細胞(ADSCs)的研究越來越多[11]。本研究通過1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)誘導SH-SY5Y細胞損傷來模擬環境毒素導致的神經元損傷,探討ADSCs-CM對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體功能的影響及其作用機制,為進一步尋找PD治療靶點和開發PD的新治療策略奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人神經母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)購自美國細胞培養物收藏中心(ATCC),ADSCs-CM由青島大學基礎醫學院干細胞再生醫學研究院提供。二辛可寧酸測定(BCA)試劑盒、線粒體復合物Ⅰ(CⅠ)活性測定試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司,MPP+(德國Sigma公司),JC-1試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司),活性氧(ROS)檢測試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)測定試劑盒線、粒體提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),兔抗人LC3/P62(英國Abcam公司)。

1.2 細胞的處理和分組

將SH-SY5Y細胞于含體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青鏈霉素的DMEM高糖培養基中,置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中常規培養,隔天更換一次培養基,每2～3 d傳代一次。將生長密度達到70%～80%的SH-SY5Y細胞分為Ctrl組、PD組和CM組,Ctrl組于完全培養基中常規培養,PD組在完全培養基中加入1.0 mmol/L的MPP+以構建PD細胞模型[12],將CM組置于含有1.0 mmol/L MPP+的ADSCs-CM中進行培養,均培養24 h。

1.3 研究方法

1.3.12,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光方法檢測SH-SY5Y細胞中ROS的含量 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,去除原有的細胞培養液后,加入1 mL用基礎培養基稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA,37 ℃下孵育20 min,然后用無血清細胞培養基沖洗細胞3次,完全去除細胞表面的DCFH-DA,通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光強度。

1.3.2ATP測定試劑盒測定SH-SY5Y細胞中ATP總量 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,嚴格按照ATP測定試劑盒測定方法操作,并使用具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀來測定各組SH-SY5Y細胞中ATP總量。

1.3.3各組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ酶活性的測定 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,嚴格按照線粒體提取試劑盒的提取方法提取線粒體蛋白,然后于線粒體蛋白中加入提取緩沖液,按照線粒體CⅠ活性測定試劑盒的操作要求,測定線粒體CⅠ的活性。

1.3.4單丹磺酰尸胺(MDC)熒光法觀察細胞自噬在處理24 h的各組SH-SY5Y細胞的6孔板中,每孔加入1 mL MDC染色液,置于37 ℃的恒溫培養箱當中避光孵育30 min。吸棄MDC染色液并使用1 mL Assay Buffer洗滌3次。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.3.5Western blot實驗檢測SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白相對表達量 在處理24 h的各組SH-SY5Y細胞中加入含有1 mmol/L苯甲烷磺酰氟的緩沖液(RIPA),采用放射免疫沉淀法提取細胞中總蛋白,并用BCA蛋白分析試劑盒對提取的蛋白進行定量。將等量的蛋白樣品(30 μg)用體積分數0.10的SDS-PAGE分離膠,轉移到PVDF上,室溫下用體積分數0.05的牛血清白蛋白(BSA)封閉3 h后,與一抗4 ℃孵育過夜。然后將二抗(1∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用增強化學發光試劑顯現反應條帶,使用ImageG-Pro Plus6軟件分析目的蛋白條帶P62、LC3和內參蛋白條帶GAPDH的灰度值,將目的蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶的灰度值進行比較,得出目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組SH-SY5Y細胞內ROS含量比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞ROS含量分別為1.00±0.00、2.23±0.41、0.74±0.06,組間比較差異顯著(F=33.46,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組細胞中ROS含量比較差異均有顯著性(tLSD=5.21、6.26,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞中ROS含量比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組SH-SY5Y細胞中ATP總量比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y中ATP總量分別為0.24±0.04、0.13±0.02、0.27±0.06,組間比較差異有顯著性(F=8.79,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組細胞的ATP總量比較差異均有顯著性(tLSD=4.00、4.02,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞的ATP總量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ活性的比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ的活性分別為19.40±1.14、10.85±3.06、18.92±3.06,組間比較差異有顯著意義(F=10.36,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組,CM組與PD組細胞線粒體CⅠ活性比較差異均有顯著意義(tLSD=4.53、3.23,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞線粒體CⅠ活性比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 各組SH-SY5Y細胞自噬水平的比較

MDC熒光染色法觀察各組SH-SY5Y細胞自噬情況,Ctrl組、PD組、CM組細胞自噬率分別為1.00±0.00、0.44±0.08、1.33±0.31,三組間比較有顯著差異(F=18.21,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組比較差異均具有顯著意義(tLSD=12.61、4.88,P<0.05),Ctrl組較CM組細胞自噬率比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組SH-SY5Y細胞中ROS含量(DCFH-DA染色,400倍)

2.5 各組SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白相對表達量比較

Western blot結果顯示,Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞中P62蛋白相對表達水平為1.00±0.00、1.26±0.05、1.10±0.05,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達水平為1.00±0.00、0.78±0.09、1.11±0.05,組間比較差異有顯著性(F=28.61、28.61,P<0.05);PD組與Ctrl組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異均有顯著性(tLSD=8.78、4.47,P<0.05),CM組與PD組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異均有顯著意義(tLSD=3.80、5.96,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3。

3 討 論

PD作為一種神經退行性疾病,影響著世界上數百萬人的身體健康和正常生活。PD潛在的發病機制和切實有效的治愈方法至今仍不明確,目前的治療方法也只能緩解患者運動障礙等癥狀,但不能阻止PD進展,也不能延長多巴胺能神經元存活時間。

圖3 各組SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白表達水平

干細胞移植已經成為治療PD等神經退行性疾病的一項非常有效的方法。最近的證據表明,干細胞移植的治療機制不是因為其具有直接分化能力,而是因為其分泌的生物活性分子發揮了相應的作用。MSCs來源的分泌體系在為受損的組織提供再生微環境的同時[13],還可以避免干細胞移植的副作用[14-15]。目前干細胞移植中存在的問題主要有移植細胞分化差、植入率和成活率低、有可能激活異體免疫排斥等[16]。干細胞所分泌的生物活性分子可以提供一個再生微環境,縮減損傷區域,建立一個自我調節的再生反應體系[17-18]。研究顯示,MSCs-CM對PD有刺激神經發生和減少神經炎癥的作用。盡管MSCs-CM有神經保護作用,但其仍然有其治療的局限性[17-18]。

線粒體功能障礙引起的神經元氧化應激在PD的發生中起著至關重要的作用?；謴途€粒體功能和抑制氧化應激已成為PD受損神經元修復的關鍵療法。本研究通過DCFH-DA染色方法對各組的SH-SY5Y細胞內ROS含量進行比較,研究結果表明,與Ctrl相比,PD組細胞的ROS含量明顯升高,與PD相比,CM組細胞的ROS產生量顯著降低,提示ADSCs-CM可降低MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中ROS的含量。在應激條件下,有缺陷線粒體數量增加,產生大量活性氧,細胞內ROS無法及時清除[19]。線粒體是參與ROS生成的主要的細胞器[20],ROS過量的產生使得細胞的抗氧化效率降低從而導致細胞產生氧化應激,對線粒體產生不利的氧化修飾,這種現象在許多涉及線粒體功能障礙的神經退行性疾病當中均可以觀察到[21]。本研究ATP合成測定結果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的ATP總量明顯降低,與PD組相比,CM組細胞的ATP總量明顯升高,提示在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中,ADSCs-CM促進了ATP的生成。ROS的過度積累會導致線粒體通透性轉換孔異常開放,線粒體膜電位下降[22]。線粒體膜電位是ATP合成的驅動力,線粒體膜電位下降會導致細胞內ATP總量降低。本研究線粒體CⅠ活性測定結果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的線粒體CⅠ活性明顯降低,與PD組相比較,CM組細胞的線粒體CⅠ活性明顯升高,提示在MPP+誘導SH-SY5Y中,ADSCs-CM提升了線粒體CⅠ的活性。由于細胞內ATP總量與線粒體CⅠ的活性相關,那么在ATP合成減少的細胞中,線粒體CⅠ活性也是降低的。本研究MDC熒光染色法結果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的自噬率明顯降低,而與PD組相比,CM組細胞的自噬率明顯升高。Western blot結果表明,PD組與Ctrl組、CM組比較,細胞中P62蛋白相對表達量顯著升高、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量顯著降低。這表明在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中,ADSCs-CM可顯著降低細胞自噬水平。自噬作為一個獨立的系統,可降解體內受損的蛋白質和細胞器。在正常情況下,自噬處于動態平衡,維持內環境穩態,但在大多數神經退行性疾病中線粒體存在功能受損情況。研究發現,ADSCs-CM可以導致線粒體自噬,從而清除受損線粒體,在氧化應激相關的PD中發揮神經保護作用[23]。

綜上所述,本研究旨在通過MPP+作用于SH-SY5Y細胞構建PD細胞模型,檢測ROS的產生量以評估MPP+誘導的氧化應激情況,并確定細胞ATP的產生和線粒體CⅠ的活性以評估線粒體功能。通過分析P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表達以及細胞自噬率來評估ADSCs-CM對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬的影響。研究數據表明,MPP+誘導SH-SY5Y細胞線粒體功能障礙,而ADSCs-CM通過線粒體自噬清除受損線粒體,改善MPP+誘導的線粒體ATP合成減少、ROS和氧化應激增加以及線粒體CⅠ活性不足的情況。

總之,本研究表明ADSCs-CM通過線粒體自噬的方式改善MPP+誘導的線粒體功能障礙和體外氧化應激反應,為PD的診斷以及治療提供了新思路。但是ADSCs-CM靶向調控P62/LC3通路在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中發揮神經保護作用的具體機制還需要進一步研究。

作者聲明：肖歡歡、尹侃參與了研究設計;肖雨、張崢、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。