嗜黏蛋白阿克曼氏菌在腸道疾病和代謝紊亂中的關鍵作用*

陳菁青 鄭建華 董巧燕 武文卿 孫天奇 邱業峰 張 睿

(軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心,北京 100071)

哺乳動物腸道內棲息著密集而多樣的微生物群落,它們與宿主共同進化,互惠共生。隨著測序分析手段的進步,特別是高通量測序技術的應用,極大地促進了人類對腸道菌群新物種的發現及功能的了解。腸道微生物群生態系統平衡的紊亂,即腸道菌群失調,與許多疾病的發生和發展密切相關[1],因此,通過調節腸道菌群改善宿主健康具有重大意義。

嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)是一種黏蛋白降解革蘭陰性嚴格厭氧菌,最初從健康人體糞便中分離獲得[2],是腸道微生物群的重要成員之一,占菌群總量的1%～5%[3],因具備介導宿主機體能量代謝和營養穩態、免疫應答、大腦活動等關鍵生理活動的功能,成為一大研究熱點。A.muciniphila豐度與肥胖、糖尿病、心血管疾病等代謝綜合征以及慢性低度炎性反應、腸炎病密切相關,且具備一定改善疾病和提高機體健康的作用,但因果關系及與宿主相互作用的機制尚不清楚[4-5]。A.muciniphila代謝特性的研究、安全和有效性評價以及與宿主調控機制的揭示為其成為一種有前景的候選益生菌奠定了基礎。本文將結合現有研究成果,闡述A.muciniphila與疾病的相互關系,重點探討其在改善宿主代謝紊亂及腸道炎性反應中的功能及可能作用機制。

1 A. muciniphila與腸道黏膜屏障

黏液是維持腸道健康及功能完整的必要組成部分,不僅是阻止外來有害物質滲透和保護腸道上皮表層的有效屏障,也是物質代謝的良好潤滑劑[6]。一方面腸道黏液為腸道微生物的生長、黏附和保護提供底物,另一方面腸道共生菌與病原微生物在管腔競爭生存空間,為黏液的生成和屏障的完整提供營養和必需分子,維持腸道黏膜屏障功能正常。此外,腸道微生物群組已被證明能夠影響腸道黏液屏障特性。炎性條件下,某些特定細菌物種豐度的升高能夠增加黏液層的通透性,從而降低屏障功能[7]。A.muciniphila廣泛定殖于人類和動物的腸道黏膜層,可代謝產生對宿主和微生物群均有益的短鏈脂肪酸,且具備增強屏障和增加黏液厚度的活性,成為黏液層中連接的關鍵菌種[8]。研究證明A.muciniphila在嬰兒早期就定殖于腸道,并在一年內菌群豐度接近健康成人水平[9]。不同年齡階段、生理狀態及腸道不同部位A.muciniphila的定殖量也不盡相同。健康人結腸中,A.muciniphila定殖數量可高達腸道菌群總量的3%,降解腸黏蛋白產生的乙酸和丙酸等主要代謝產物可進一步被Faecalibacterium.prausnitzii利用產生丁酸鹽,抑制腸道免疫和腸道通透性[10]。

A.muciniphila具備有效的調節宿主免疫、提高腸道屏障的功能,且可能在黏膜中抑制病原微生物定殖、提高宿主共生菌競爭力等方面也發揮積極作用[11]。A.muciniphila的豐度與纖瘦程度正相關,可減輕體質量、提高代謝活性,并調節黏液厚度,恢復腸道屏障的功能[12-13]。值得注意的是,在炎癥性腸病(主要是潰瘍性結腸炎)和代謝紊亂的患者中,觀察到低豐度的A.muciniphila,表明它可能具有潛在的抗炎特性[14]。最新實驗表明,A.muciniphila增加了內源生物活性物質尤其是胰高血糖素樣肽2的產生,參與腸道屏障調節。A.muciniphila在代謝和免疫反應中分子特性的發現及作用機制的揭示有助于挖掘其潛在的治療應用價值。

2 A. muciniphila與炎性腸炎病

宿主腸道黏蛋白與細菌之間的相互關系受菌群結構變化的影響,黏蛋白降解菌可能參與腸道疾病的發生。研究證明A.muciniphila的豐度與炎癥腸病、肥胖癥、糖尿病和闌尾炎等疾病的發生負相關,但免疫學作用機制尚不清楚。腸炎患者糞便微生物群中存在A.muciniphila的缺失[15];活檢結果也顯示,與健康人群相比,炎性腸炎病患者腸黏膜A.muciniphila豐度較低[16]。此外,急性闌尾炎患者體內A.muciniphila數量也減少,且豐度與闌尾炎的嚴重程度成反比[17]。與健康人相比,潰瘍性結腸炎患者和克羅恩患者腸道中A.muciniphila的豐度也顯著降低[18-19],而經過標準化-糞便微生物群移植后,A.muciniphila的定殖率和豐度顯著增加[20]。然而,也有少量研究報道指出克羅恩患者腸道A.muciniphila的豐度與健康人相比有所增加[16]。總體來看,人體實驗結果表明炎癥性腸炎病的發病和A.muciniphila的豐度通常呈負相關,提示其在炎癥性腸炎病治療中的潛力。

利用動物進行炎癥性腸炎病造模,對于研究其病因、發病機制、臨床治療等方面具有十分重要的意義。炎癥性腸病動物模型的構建方法有多種,常用葡聚糖硫酸鈉、三硝基苯磺酸等化學物質誘導[21],或利用基因編輯方法敲入或敲除某些基因構建等途徑[22]。利用這些方法在成功構建的腸炎小鼠模型中也發現了A.muciniphila豐度的降低,與人體實驗結果相一致[23-24]。然而,也有少量文章報道了與上述相反的結論,即在結腸炎小鼠模型中存在A.muciniphila含量升高的現象。結論的不一致可能受各種不同實驗因素的影響,例如使用的模型不同,如對Cyp27b1、Hes1和IL-10等不同基因敲除,或用DSS、TNBS等不同誘導劑誘導等方法構建結腸炎模型等。因此,不同模型下A.muciniphila對腸黏膜炎癥的發病作用仍需要進一步的探索。

炎性反應是一種先天免疫反應模式,多項研究表明A.muciniphila參與了腸道免疫-炎性反應的調控過程,而揭示因果關系最直接的方法是利用A.muciniphila進行干預。研究顯示灌喂A.muciniphila或Amuc_1100膜蛋白可有效減少DSS誘導小鼠結腸中巨噬細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞的浸潤,同時減少結腸炎小鼠脾和腸系膜淋巴結中的CD16/32+巨噬細胞,緩解結腸炎。此外,A.muciniphila可以通過宿主-微生物互作,改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的腸道屏障功能,降低炎性細胞因子水平,提高腸道微生物群多樣性,緩解腸道炎性反應[25]。A.muciniphila還可增加腸道內短鏈脂肪酸的產生,促進調節性T(Treg)細胞的分化,改變腸道微生物群的組成[26]。腸道中產生的短鏈脂肪酸可以激活G蛋白偶聯受體43 (GPR43),從而增加結腸中Foxp3+Treg的數量,調節免疫反應并緩解結腸炎[27]。體外實驗結果證明了人源型A.muciniphilaMucT(ATCC BAA-835T) 菌株與鼠源性A.muciniphila139菌株均具有抗炎作用效果[26,28]。體內實驗結果顯示,ATCC BAA-835T菌株可以顯著改善DSS誘導的慢性結腸炎小鼠的腸道炎性反應,而小鼠來源的A. muciniphila 139未發現有相同的改善效果,提示A.muciniphila的益生效果存在菌株特異性。上述研究表明,A.muciniphilaMucT可能是改善和治療炎性腸炎病的一種極具前景的益生菌,但作用機制及不同菌株的改善效果還需要進行深入探究。

宿主的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)能夠識別細菌相關分子模式,誘導免疫-炎性反應[29]。核苷酸寡聚化結構域樣受體(nucleotide oligomerization domain like receptors,NLRs)和Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是膜上重要的模式識別受體,直接參與細菌的識別,在免疫系統調節中起關鍵作用。TLR是腸道最有代表性的模式識別受體,其中TLR2/4/5等與細菌識別有關。NLRs和TLRs激活報告實驗發現A.muciniphila能特異性激活TLR2受體[30],而TLR2已被廣泛證明可調節腸道穩態和代謝[29,31],參與腸道微生物與宿主的相互作用。在對HEK-Blue細胞的研究中有研究[12]也觀察到了相同的結果。通過對A.muciniphila外膜進行基因組和蛋白質組學分析,揭示A.muciniphila與TLR2受體之間的作用機制[32]。結果顯示,Amuc_1100蛋白是A.muciniphila外膜中最豐富的蛋白之一,且與菌毛的形成有關,推測其可能參與A. muciniphila與宿主之間的相互作用。為了驗證這一推測,研究者利用大腸埃希菌表達系統外源表達Amuc_1100蛋白,發現其具備與A.muciniphila一樣可激活TLR2表達細胞的能力,進一步證實了Amuc_1100蛋白直接參與A.muciniphila與宿主之間的相互作用[13]。此外,體外實驗結果顯示Amuc_1100在巴氏滅活處理溫度下仍保持穩定,相對耐熱。差分光散射分析顯示Amuc_1100的融解溫度為70° C,恰為巴氏滅菌的使用溫度。因此,在巴氏殺滅活處理后,Amuc_1100仍然可能具有活性,并有助于對宿主信號的傳導,其功能的穩定可能與巴氏滅活A.muciniphila的益生作用密切相關。通過比較發現,Amuc_1100能有效重復出A.muciniphila的益生作用,且無論活菌、巴氏滅活A.muciniphila以及Amuc_1100均能降低高脂誘導小鼠高膽固醇含量[30]。此外,與活菌相比,巴氏滅活的A.muciniphila及Amuc_1100還能夠特異性降低高脂誘導小鼠甘油三酯含量,進一步證實了巴氏滅菌處理能夠有效加強A.muciniphila對宿主的保護作用,這一現象的潛在機制可能是熱處理暴露了A.muciniphila的活性物質或分子(包括Amuc_1100蛋白等)或抑制性化合物及其組合的失活。

3 A. muciniphila改善代謝性疾病

“代謝紊亂”存在肥胖和胰島素抵抗等多種臨床表現,大大增加了患2型糖尿病或心血管疾病的風險。肥胖模型腸道通透性增加,引起革蘭陰性菌的脂多糖穿透屏障進入血液循環,引起代謝性內毒素血癥[33]。已有一系列關于腸道微生物群與代謝綜合征相互關系的報道。此外,在一項開創性的人類糞便微生物群移植研究中,代謝綜合征患者分別接受來自正常個體或代謝紊亂個體的糞便移植。6周后,僅在接受正常供體糞便微生物移植的治療組中觀察到胰島素敏感性的提高[34]。腸道微生物群改變人類代謝健康的論據已被廣泛接受[35],人體研究結果有效的支持了調控腸道菌群改善代謝綜合征。然而,目前還沒有被證明能夠可靠有效的影響和反應人類代謝疾病標志物變化的菌株,因此,針對代謝疾病的微生物治療方法還需進一步開發。

A.muciniphila豐度與個體的纖瘦程度呈正相關,作為一種有前途的“下一代”益生菌脫穎而出。此外,通過藥物或手術途徑改善代謝綜合征患者的方法均已證實與他們腸道中A.muciniphila相對豐度的增加有關[36]。高脂誘導肥胖小鼠灌喂A.muciniphila活菌可提高胰島素敏感性,并降低血液循環中的促炎細菌脂多糖的含量[30]。腸源性全身脂多糖濃度的升高能夠加劇胰島素抵抗和代謝綜合征的發生和發展。有研究進行了一項為期3個月的隨機雙盲人體實驗研究,使超重/肥胖或胰島素抵抗受試者每日接受等劑量的A.muciniphila活菌或巴氏溫和熱滅活的A.muciniphila,探究其對代謝紊亂的改善作用[37]。益生菌菌株通過巴氏溫和熱滅活可以提高其治療用途的安全性,并且已被證明巴氏熱滅活可以保留相關益生作用的衍生物[38]。此前,小鼠研究結果顯示巴氏滅活處理的A.muciniphila增強了降低小鼠脂肪沉積、胰島素抵抗和血脂異常的能力。臨床實驗結果[37]顯示,每日接受不同處理的A.muciniphila,實驗周期為3個月,具有良好的安全性和耐受性,且與對照組相比,接受巴氏熱滅活A.muciniphila的治療個體循環胰島素水平較低,胰島素抵抗指數和血液總膽固醇也較低,這表明A.muciniphila的膜成分或其他組分具備改善胰島素敏感性和血脂含量的功能。此外,巴氏滅活A.muciniphila菌治療的個體,體循環中二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPPIV)含量更低,而DPPIV酶能夠降解胰高血糖素樣肽1(glucagonlike peptide 1,GLP-1),一種能夠增強胰島素分泌并具有免疫調節特性的腸道激素。

城鄉學生形態指標比較（表1）調查顯示，城市男生身高、體重、胸圍等3項指標高于農村男生，差異有統計學意義（P＜0.01），城市女生身高、坐高高于農村女生，差異有統計學意義（P＜0.01）。

肥胖和2型糖尿病患者通常伴隨血液白細胞數量的升高[39],且受腸道菌群改變的影響,肥胖患者呈現慢性低度炎性反應[40]。巴氏滅活A.muciniphila菌能夠有效降低肥胖患者血液白細胞的數量,緩解代謝性內毒素血癥,與前期報道的A.muciniphila菌具有抗炎作用的臨床前研究結果相一致。此外,巴氏滅活A.muciniphila菌能夠顯著降低小鼠血清中肝功能標志物谷氨酰轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶,以及組織損傷標志物-血清乳酸脫氫酶和肌酸激酶的含量[5,30]。與肥胖小鼠的研究結果相一致,人體實驗結果也指出,與活菌相比,巴氏滅活處理的A.muciniphila對機體代謝炎性反應和脂肪肝、心血管疾病等代謝綜合征具有更好的改善效果。然而,目前尚不清楚巴氏殺滅活A.muciniphila菌更有效緩解代謝綜合征的原因。推測可能是由于巴氏滅活處理后細菌雖無法繁殖,但保持了完整活性成分并防止產生抑制作用的分子,有助于觸發有益的宿主反應。細菌代謝物、細胞壁成分和細菌肽為治療與超重和肥胖相關的代謝并發癥提供了一個新治療策略。事實上,此前同一研究團隊已從A.muciniphila的細胞壁中表達純化了Amuc_1100蛋白,并證明了該蛋白在高脂誘導肥胖小鼠中具有與巴氏滅活A.muciniphila菌同樣的治療效果。腸道微生物中常見革蘭陽性菌豐富的細胞壁成分-胞壁酰二肽,也可以緩解肥胖小鼠胰島素抵抗和提高葡萄糖耐受性[41],進一步證明了細菌來源的分泌因子、細胞成分和代謝物等后生元物質,可以改善代謝疾病。益生菌衍生物或其組分的應用可以克服活菌使用過程中的一些局限性,不僅可以提高治療的安全性,還可以提高基于微生物的療法在代謝疾病中的功效。雖然已有小規模人體實驗研究證明了巴氏殺菌A.muciniphila應用的安全性和有效性,但仍需要更大規模的人體臨床實驗來驗證巴氏殺菌A.muciniphila在超重或肥胖等代謝異常個體中的治療效果。

4 結語

A.muciniphila自2004年被發現以來,大多研究都將其的豐度與其益生作用聯系起來[42]。如今,A.muciniphila被廣泛認為是改善肥胖、糖尿病、肝疾病和心臟疾病等相關代謝紊亂疾病的一種益生菌,而事實也證明,通過A.muciniphila的治療可以大大緩解這類疾病的發生。通過比較分析,發現已鑒定的下一代有益微生物中,人類腸道菌群中的A.muciniphila是一種非常有前景的候選細菌,且目前的研究結果和功能的發現已為A.muciniphila作為后續益生菌微生態制劑的應用邁出了一大步。首先,通過對A.muciniphila培養條件的優化,已能在人工合成培養基中成功培養出能夠快速繁殖和具有活性的A.muciniphila[43]。其次,研究發現巴氏滅活A.muciniphila具有更好的益生效果,解決了活菌應用過程中需考慮的運輸、儲存條件、保質期和穩定性等問題。第三,Amuc_1100蛋白的鑒別和功能鑒定,揭示了A.muciniphila菌與宿主之間相互作用的關鍵機制。第四,小規模人體試驗證明了A.muciniphila菌的安全有效性。最重要的是,巴氏滅活A.muciniphila菌以及細菌成分,例如相對分子質量較小的30 kU Amuc_1100蛋白的分離和鑒定,為基于A.muciniphila及其產物和衍生物,開發針對糖尿病、炎癥性腸病或腸屏障功能受損疾病等的藥物研究打開了大門。